林秀英 韓振東 王佳勇 崔堯 張忠太

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院皮膚科,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

近年來(lái),接受腎移植的患者也越來(lái)越多。據(jù)統(tǒng)計(jì),30%～58%的腎移植患者在移植后可并發(fā)皮膚鱗狀細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱鱗癌),其極具侵襲性,嚴(yán)重影響腎移植患者的身體健康[1]。臨床研究[2]表明,依曲替酸可有效抑制腎移植患者并發(fā)的皮膚鱗癌的生長(zhǎng)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),依曲替酸能夠誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞系SCL-1細(xì)胞凋亡[3],但其抗癌機(jī)制尚未完全闡明。本研究應(yīng)用依曲替酸處理皮膚鱗癌細(xì)胞系SCC13細(xì)胞,觀察依曲替酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況,并探討其可能的分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要材料和試劑 依曲替酸購(gòu)自重慶華邦藥業(yè)公司。細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。二甲基亞砜(DMSO)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。Cell Death Detection ELISAPLUS試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司。Annexin-V-FITC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。Trizol RNA提取試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。cDNA第1鏈合成試劑盒、Real-MasterMix新型熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。引物由北京賽百盛公司合成。Fas中和抗體ZB4購(gòu)自美國(guó)Upstate公司。SCC13細(xì)胞系由德國(guó)柏林自由大學(xué)惠贈(zèng)。依曲替酸用DMSO配置成 1×10-1mol?L-1的貯存液-20℃避光保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SCC13細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、100 U?mL-1青霉素、100 U?mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Cell Death Detection ELISA檢測(cè)細(xì)胞凋亡于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期向SCC13細(xì)胞中加入濃度分別為5×10-7、1×10-6、5 ×10-6、1 ×10-5、5×10-5mol?L-1依曲替酸各3個(gè)復(fù)孔,對(duì)照組加等體積的DMSO,分別培養(yǎng)1、3、5 d后按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)凋亡。

1.2.3 Annxin-V和PI結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)早期凋亡 1×10-5mol?L-1的依曲替酸作用于SCC13細(xì)胞72 h后,收集細(xì)胞,Annxin-V和PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測(cè) Fas、FasL mRNA表達(dá) 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)Fas、FasL及內(nèi)參基因 β-actin引物。Fas引物上游:5′-AAGTGACTGACATCAACTCC-3′、下游 :5′-CCACTTCTAAGCCATGTCC-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物270bp;FasL 引物上游:5′-ACATGAGGAACTCTAAGTATCCC-3′、下游:5′-CAAAATTGACCAGAGAGAGC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物 174 bp;β-actin 引物上游:5′-TCATCACCATTGGCAATGAGC-3′、下游:5′-CAGCACTGTGT TGGCGTACA GGT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物158 bp。收集經(jīng) 1×10-5mol?L-1依曲替酸作用 0、6、12、24、36、48 h 的 SCC13細(xì)胞,按T rizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA,定量測(cè)定后按cDNA第1鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT反應(yīng),逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:70℃5min,25℃10min,42℃50min,95℃5min;在 RG3000定量PCR儀上,按照RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng):95℃起始變性2min,94℃變性20 s,56℃退火30 s,68℃延伸30 s。用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)Fas、FasL基因進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。

1.2.5 阻斷實(shí)驗(yàn) 1μg?mL-1Fas中和抗體ZB4預(yù)處理 SCC13細(xì)胞10min后,加入1×10-5mol?L-1依曲替酸,作用24 h,用Annxin-V和PI結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,同時(shí)以單獨(dú)應(yīng)用ZB4、依曲替酸和對(duì)照組SCC13細(xì)胞做比較,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 依曲替酸對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用 隨著依曲替酸作用濃度的增加,SCC13細(xì)胞凋亡程度逐漸升高;在相同的作用濃度下,隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡程度亦逐漸升高,呈現(xiàn)明顯的濃度及時(shí)間依賴性,P＜0.05。(圖1)。

2.2 Annexin-V和PI雙標(biāo)記法檢測(cè)凋亡率 對(duì)照組早期凋亡率僅為6.18%(圖1A),依曲替酸處理SCC1372 h后,細(xì)胞的早期凋亡現(xiàn)象明顯,Cell Quest軟件分析其72 h細(xì)胞早期凋亡率為26.27%(圖1B)。

2.3 Fas、FasL mRNA表達(dá)變化 分析實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果,以0 h組為基準(zhǔn),預(yù)設(shè)其 Fas、FasL mRNA表達(dá)水平均為 1.0,經(jīng)依曲替酸作用 12、24、36、48 h的SCC13細(xì)胞Fas、FasL mRNA表達(dá)水平均顯著上升,與0 h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而依曲替酸作用SCC13細(xì)胞6 h后的Fas,FasL mRNA表達(dá)水平與0 h組比較無(wú)顯著差異(表1)。

圖1 Annexin-V和PI雙標(biāo)記法檢測(cè)依曲替酸誘導(dǎo)SCC13細(xì)胞凋亡

表1 依曲替酸作用SCC13細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后FAS,FASL mRNA相對(duì)定量結(jié)果

2.4 阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果 單獨(dú)應(yīng)用Fas中和抗體ZB4對(duì)細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響作用。單獨(dú)應(yīng)用依曲替酸的早期凋亡率為(16.76±1.04)%,與ZB4共同處理SCC13后,早期凋亡率下降為(7.12±0.85)%,表明ZB4可有效阻斷依曲替酸誘導(dǎo)的凋亡(P＜0.05,圖 2)。

圖2 ZB4對(duì)依曲替酸誘導(dǎo)SCC13細(xì)胞凋亡的阻斷作用

3 討 論

依曲替酸是第2代維甲酸類藥物。維甲酸類藥物具有廣泛的生物活性,能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化,是目前唯一可有效預(yù)防皮膚腫瘤的化合物[4]。一些臨床試驗(yàn)和病例報(bào)告證實(shí)依曲替酸能有效地預(yù)防實(shí)體器官移植患者并發(fā)的皮膚非黑色素腫瘤的生長(zhǎng),尤其是減少腎移植患者鱗癌和日光性角化病的發(fā)生[2]。也有報(bào)道[5-6]依曲替酸能治療原發(fā)性多發(fā)的皮膚疣狀癌及銀屑病患者因應(yīng)用光化學(xué)療法后并發(fā)的皮膚多發(fā)鱗癌。

凋亡是機(jī)體清除腫瘤細(xì)胞的一種重要方式,許多抗癌藥物是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮治療作用的。本研究ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,依曲替酸能誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞SCC13凋亡,并與藥物有明顯的濃度及時(shí)間依賴性。Annxin-V和PI結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這種凋亡的誘導(dǎo)作用。

目前認(rèn)為主要有2條通路參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生,即外源性死亡受體通路和內(nèi)源性線粒體通路[7]。Fas/FasL通路是重要的外源性途徑。Fas與FasL相結(jié)合,通過(guò)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)啟動(dòng)凋亡的發(fā)生。Fas/FasL介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異?？纱龠M(jìn)皮膚腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。應(yīng)用藥物調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)Fas分子的表達(dá)以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗作用是皮膚鱗癌治療藥物的作用機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn),依曲替酸作用SCC13細(xì)胞12 h后,腫瘤細(xì)胞體內(nèi)Fas與FasL的mRNA表達(dá)水平顯著升高,并與作用時(shí)間有明顯的依賴性,這與ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的,提示Fas參與了依曲替酸誘導(dǎo)的皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡。Fas誘導(dǎo)的凋亡是通過(guò)Fas與FasL的結(jié)合啟動(dòng)的。ZB4作為中和性抗體可通過(guò)影響Fas與FasL的結(jié)合而阻斷凋亡的發(fā)生。本研究中的阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單獨(dú)應(yīng)用ZB4不能阻斷凋亡,當(dāng)與依曲替酸共同作用后腫瘤細(xì)胞的凋亡率顯著下降,因此進(jìn)一步證明Fas與FasL的結(jié)合參與了依曲替酸誘導(dǎo)的凋亡。

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6 Lebwohl M,Tannis C,Carrasco D.Acitretin suppression of squamous cell carcinoma case report and literature review[J].J Dermatol Treat,2003,14(2):3-6.

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