周 斌，杜俊成

（湖北省襄樊職業(yè)技術學院生物工程學院，湖北 襄樊 441050）

2009年4月初，襄樊附近某家養(yǎng)殖場的蛋雞發(fā)病，并有死亡。通過臨床癥狀和病理解剖初診為大腸桿菌病。從現(xiàn)場采集病死雞，經(jīng)解剖無菌采集病料，通過病原分離和生化培養(yǎng)等試驗，最終確定病原體為禽致病性大腸桿菌，分離的大腸桿菌用臨床常用的抗生素進行藥敏試驗。根據(jù)藥敏結果合理選擇藥物，有效控制了該雞場的病情。

1 材料

1.1 病料來源 無菌采集養(yǎng)殖場病死雞的肝臟、心臟、脾、十二指腸等樣本。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 血液培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基，細菌生化鑒定管，腸桿菌科細菌生化常規(guī)微量鑒定管（杭州微生物試劑有限公司）；試劑：細菌生化微量試驗試劑盒（杭州微生物試劑有限公司），革蘭氏染液（自配），以及解剖器械等。

1.3 藥敏紙片 用常用的氧氟沙星、氨卞西林、乙酰甲喹、慶大霉素、丁胺卡那、氟苯尼考、阿莫仙、頭孢噻肟鈉、頭孢塞呋、鏈霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、強力霉素、替米考星、粘菌素、諾美沙星、恩諾沙星、泰樂菌素進行藥敏試驗。

1.4 主要試驗設備 恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、無菌工作臺、高壓滅菌鍋、pH紙、電爐、冰箱。

1.5 試驗動物 健康的小白鼠。

2 方法

2.1 動物解剖 從發(fā)病場采集病雞和病死雞進行解剖，先觀察活雞的外部癥狀，其表現(xiàn)為精神沉郁、呆立、昏睡閉眼、共濟失調、下痢。剖檢可見心外膜、冠狀脂肪出血，蛋雞卵子有大量的血斑、出血、水腫。

2.2 細菌的分離培養(yǎng) 無菌采集病死雞的肝臟、心臟、脾、十二指腸等樣本，分別劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基上，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h。

2.3 純培養(yǎng) 挑取麥康凱培養(yǎng)基上粉紅色的單個菌落在麥康凱培養(yǎng)基上劃線純培養(yǎng)，再將純培養(yǎng)物接種到普通培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，取出置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 細菌染色鏡檢 用滅菌接種環(huán)挑取麥康凱培養(yǎng)基和血液培養(yǎng)基的單個菌落進行革蘭氏染色。

2.5 生化試驗 挑取上述麥康凱培養(yǎng)基或血液培養(yǎng)基的菌落接種到大腸桿菌培養(yǎng)基上，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24h，觀察細菌在培養(yǎng)基上生長的基本特征。參照生化鑒定的使用說明書，挑取麥康凱培養(yǎng)基或血液培養(yǎng)基的單個菌落接種到腸桿菌科細菌生化常規(guī)鑒定管內，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，按規(guī)定時間對菌株的生化結果進行判斷。

2.6 藥敏試驗 用2.5～3mL的生理鹽水注入純培養(yǎng)培養(yǎng)基里將細菌洗涂均勻后，均勻涂布在整個普通培養(yǎng)基上，待普通培養(yǎng)基上的菌液稍干后，將藥片依次均勻貼放到平板上，藥片與藥片之間相距1～2 cm，藥片距平板邊緣1 cm，將平皿倒置37℃培養(yǎng)16～18h后觀察結果，并測量抑菌圈的直徑。

3 結果

3.1 細菌的培養(yǎng)特性 病料在血液培養(yǎng)基上生長良好，形成一種圓形凸突，光滑濕潤，邊緣整齊，半透明，呈中等大小的灰白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上形成直徑為1～2mm左右，光滑濕潤的紅色菌落。

3.2 染色鏡檢結果 為革蘭氏陰性小桿菌，兩端鈍圓，散在或成對存在。

3.3 生化試驗結果 分離菌株的生化試驗結果見表1。分離菌株的生化特性完全符合大腸桿菌的特性。綜合解剖癥狀、培養(yǎng)特征、鏡檢特征、生化試驗結果，可鑒定此分離菌株為致病性大腸桿菌。

表1 生化試驗結果

3.4 藥敏結果 見表2

3.5 動物試驗結果 給小白鼠注射此細菌24～48h內全部死亡，剖檢死亡小白鼠，發(fā)現(xiàn)其肝臟腫脹出血，心外膜出血，對死亡小白鼠的肝臟、心臟等病料進行涂片鏡檢，所觀察到的菌株與原分離細菌一致，說明此菌株為致病性大腸桿菌。

表2 藥敏試驗結果

4 小結與討論

4.1 根據(jù)解剖癥狀、培養(yǎng)特征、鏡檢特征、生化試驗結果，可判斷此分離菌株為致病性大腸桿菌。雞的大腸桿菌是由大腸桿菌某些血清型菌株引起的一類疾病的總稱。本病一年四季均可發(fā)生，各個品種、日齡都可發(fā)病，但雉雞最易感染，發(fā)病率可達30%～60%，死亡率可達100%。

4.2 大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細菌，由于近年來抗菌藥使用頻繁，不合理使用及加大量使用，甚至濫用，使得臨床耐藥菌株不斷增加。由于不同地區(qū)的致病性大腸桿菌可能不同，若要控制當?shù)夭∏?，減少損失，就應及時分離出病原并進行藥物敏感性試驗，選出敏感藥物進行防治。

通過對襄樊某養(yǎng)殖場臨床分離的致病性大腸桿菌進行藥物敏感性試驗，得出該致病性大腸桿菌菌株對氧氟沙星、丁胺卡那、恩諾沙星、氟苯尼考、慶大霉素、粘菌素高度敏感，對乙酰甲喹、環(huán)丙沙星、卡那霉素、阿莫仙、頭孢塞呋有較強的耐藥，對泰樂菌素、頭孢噻肟鈉、強力霉素、鏈霉素、替米考星、氨卞西林耐藥。這些結果與何敏等報道的河南地區(qū)致病性大腸桿菌的耐藥性差異較大，其結果是對頭孢噻呋、粘菌素仍較敏感，這可能與不同地區(qū)的飼養(yǎng)管理、藥物的經(jīng)驗性使用及飼養(yǎng)環(huán)境不同有關。

根據(jù)藥敏結果選擇高敏感藥物氟苯尼考的可溶性粉劑對全場雞混飲（100mg/L），每天2次，每次飲水2 h，連用1周；同時加強雞舍環(huán)境衛(wèi)生消毒，加強溫度、濕度、通風管理等，有效地控制了雞只死亡，漸漸使雞場整個病情有所好轉。

[1]WS/T125-1999.中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準——紙片法抗菌藥物敏感試驗標準[S].中華人民共和國衛(wèi)生部，2000.

[2]韓文俞.病原細菌檢驗技術[M].長春：吉林科學技術出版社，1992.

[3]何 敏.河南信陽雞場大腸桿菌耐藥性調查[J].中國家禽，2010.