鄧方閣,李玉林
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力及多向分化潛能,在不同的誘導(dǎo)條件下,可向多種組織細(xì)胞分化[1-5]。目前,利用MSCs多向分化潛能及其可自體利用且無(wú)免疫排斥等特性,作為種子細(xì)胞用于組織工程學(xué)和基因工程學(xué)研究已成為熱點(diǎn)。本研究在體外分離人骨髓血,利用密度梯度離心及貼壁篩選法分離培養(yǎng)出人MSCs(human MSCs,hMSCs),分別利用3種不同的條件誘導(dǎo)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)hMSCs向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及心肌細(xì)胞分化,為細(xì)胞移植、組織再生修復(fù)可能的自體來(lái)源提供理論基礎(chǔ)。
1.1 主要試劑 Percoll(Pharmacia,Biotec,USA),LDMEM,HDMEM和10%胎牛血清(均Hyclone,USA),100 U/ml青鏈霉素雙抗 (華北制藥廠),0.125%~0.250%胰酶(Promega,USA),鼠抗人單克隆抗體 CD31、CD34、CD44、CD45、CD105(Neomarker,USA),地塞米松、吲哚美辛、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxan- thine,IBMX)、抗壞血酸、β2甘油磷酸鈉、阿扎胞苷(5-氮雜胞苷,5-azacitidine,5-Aza)、油紅O(Sigma,USA)。
1.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及免疫表型檢測(cè) 方法同文獻(xiàn)[6]所述,在無(wú)菌狀態(tài)下取自愿捐獻(xiàn)者的肝素化的穿刺骨髓血3~5 ml,利用Percoll(比重為1.073 g·ml-1)密度梯度離心,抽取單個(gè)核細(xì)胞層,用含青鏈霉素雙抗(100 U/ml)的10%胎牛血清的L-DMEM 重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù)以(3~4)×106的細(xì)胞密度接種在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。接種后3 d首次換液,每隔3~4 d換液一次。當(dāng)原代細(xì)胞接近匯流(>80%融合)時(shí),0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng),取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的傳代hMSCs用于后續(xù)研究。胰酶消化收集細(xì)胞,1×106個(gè)/mL細(xì)胞與一抗單克隆抗體 CD31 、CD34、CD44、CD45、CD105 孵育液常溫下孵育30~40 min。PBS洗滌2次后與FITC標(biāo)記的二抗4℃避光孵育20~30 min。PBS沖洗2次后加500 μ l PBS重懸細(xì)胞,用于流式細(xì)胞儀分析。
1.3 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的傳代hMSCs,以2×105個(gè)/cm2密度接種于置有處理過(guò)的蓋玻片的24孔板中,當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到60%~70%時(shí),更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(地塞米松1μ mol/L,β2甘油磷酸鈉 10 mmol/L,抗壞血酸 50 μ mol/L)、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(地塞米松1 μ mol/L,吲哚美辛0.2 mmol/L,胰島素10 mg/L,IBMX 0.5 mmol/L),每隔3 d更換培養(yǎng)液1次,繼續(xù)誘導(dǎo)14 d后固定細(xì)胞,進(jìn)行堿性磷酸酶染色檢測(cè)或油紅O染色檢測(cè)。
1.4 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的傳代hMSCs以2×105個(gè)/cm2密度接種于置有處理過(guò)的蓋玻片的24孔板中,當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到 60%~70%時(shí),更換成 1%FBS的HDMEM饑餓培養(yǎng)24 h,后換成心肌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(5-Aza,10 μ mol/L)孵育 24 h,再換成不含誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d,細(xì)胞固定,進(jìn)行PTAH染色。
2.1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及免疫表型 接種的骨髓單個(gè)核細(xì)胞,3 d后逐漸貼壁生長(zhǎng),經(jīng)2~3次完全換液后,貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一,呈長(zhǎng)梭形。培養(yǎng)至10~18 d,細(xì)胞出現(xiàn)80%~90%的融合。傳代后的hMSCs形態(tài)上更加趨于一致,均為緊密排列的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(圖1)。流式細(xì)胞檢測(cè)表明,hMSCs表達(dá)CD44、CD105,不表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31、造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和白細(xì)胞表面抗原CD45。表型檢測(cè)參見(jiàn)前期實(shí)驗(yàn)論文[5]。
圖1 傳代后的hMSCs(HE ×200)
2.2 多向分化潛能的鑒定
2.2.1 成骨誘導(dǎo) 細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)4~5 d,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞由原來(lái)的成纖維細(xì)胞樣變?yōu)槎嘟切?誘導(dǎo)1周,80%以上的細(xì)胞為不規(guī)則形,誘導(dǎo)2周,細(xì)胞間相互融合,并形成散在的細(xì)胞結(jié)節(jié)。堿性磷酸酶染色顯示,聚集成的結(jié)節(jié)區(qū)呈棕黑色,表明此結(jié)節(jié)為鈣鹽沉積(圖2)。
圖2 hMSCs分化為成骨細(xì)胞(堿性磷酸酶染色 ×250)
2.2.2 成脂肪誘導(dǎo) hMSCs在成脂肪誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)3d,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微小脂滴,細(xì)胞形態(tài)也逐漸由成纖維樣細(xì)胞變?yōu)榘w增寬的短梭形、圓形或多角形,培養(yǎng)2周時(shí),細(xì)胞內(nèi)的脂滴增大,并相互融合。油紅O染色顯示,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,脂滴被特染成紅色,與油紅O染色陽(yáng)性對(duì)照的人脂肪細(xì)胞相似,表明成脂分化的hMSCs在細(xì)胞化學(xué)特性上已具有與人脂肪細(xì)胞相似的細(xì)胞化學(xué)特性(圖3)。
圖3 hMSCs分化為脂肪細(xì)胞(油紅O染色 ×200)
2.2.3 成心肌誘導(dǎo) 細(xì)胞經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)1周,細(xì)胞變化并不明顯,部分細(xì)胞變長(zhǎng)或變寬大;誘導(dǎo)2周,細(xì)胞逐漸由長(zhǎng)梭型變成多爪型或星型。PTAH染色顯示,經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)后的細(xì)胞,胞漿呈藍(lán)色。通過(guò)與SD乳鼠心肌細(xì)胞 PTAH染色相比較,提示成心肌細(xì)胞分化的hMSCs在細(xì)胞化學(xué)特性上具有與 SD乳鼠心肌細(xì)胞相似的細(xì)胞化學(xué)特性(圖 4)。
組織器官移植可能是人類攻克某些重大疾患如心腦血管疾病、癌癥、老年性疾病等的根本措施。正因?yàn)檫@些取自人胚胎或骨髓的具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體的干細(xì)胞,可用于培育不同的人體細(xì)胞、組織或器官,有望成為移植器官的新來(lái)源。但是,由于胚胎干細(xì)胞在倫理道德等方面的制約而備受爭(zhēng)議,因此骨髓來(lái)源的干細(xì)胞越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。
圖4 成心肌誘導(dǎo)后的hMSCs分化為心肌細(xì)胞(PTAH染色 ×200)
目前,普遍認(rèn)為,在骨髓中至少存在兩種干細(xì)胞群,即造血干細(xì)胞和MSCs。MSCs是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞,可通過(guò)體外貼壁培養(yǎng)加以分離,不僅能分化為造血實(shí)質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞等,還分化為多種造血以外的組織,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源組織的細(xì)胞[1-5]。隨著干細(xì)胞工程及其相關(guān)生物技術(shù)研究發(fā)展,以及對(duì)干細(xì)胞本身特有的特性認(rèn)識(shí),使得研究者在體外培養(yǎng)動(dòng)物MSCs,體外定向誘導(dǎo)分化為所需的不同細(xì)胞,同時(shí)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已成功證實(shí)MSCs的修復(fù)作用,如在鼠的慢性肢體缺血模型中,MSCs參與血管形成,表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞標(biāo)志[7];將MSCs移植入鼠的心肌梗死區(qū),可分化成心肌細(xì)胞,充填梗死病灶,并與心肌細(xì)胞形成縫隙連接,誘導(dǎo)血管新生,從而形成了有功能的心肌組織[8-9];將體外擴(kuò)增的MSCs裝入擴(kuò)散小室(多孔陶瓷或陶瓷柱)后再移植入動(dòng)物體內(nèi),擴(kuò)散小室內(nèi)的MSCs能夠利用宿主動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)合成骨和軟骨[10];將建系的鼠胚胎干細(xì)胞[11]或少量部分分化的胚胎干細(xì)胞形成的胚體細(xì)胞[12]植入帕金森病小鼠,可分化為多巴胺神經(jīng)元。從理論上來(lái)說(shuō),由于使用的是來(lái)自患者自身組織培養(yǎng)擴(kuò)增的治療用細(xì)胞,因此移植時(shí)患者體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。此外,干細(xì)胞可無(wú)限高度增殖,在數(shù)量上以保證治療的需要,從而解決了可供移植細(xì)胞、組織或器官嚴(yán)重不足的問(wèn)題。隨著整體社會(huì)的老年化,每年都有數(shù)以百計(jì)的患者需要進(jìn)行修復(fù)或移植,干細(xì)胞工程及其相關(guān)生物技術(shù)研究將可能解決這些問(wèn)題,為人類的健康與長(zhǎng)壽帶來(lái)新的希望。
迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)MSCs的特異性表面標(biāo)志[2-3],因而缺乏直接的鑒定方法。目前判斷體外培養(yǎng)的MSCs主要采用聯(lián)合鑒定方法[1-4]:(1)體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)為均一的梭形、紡錘狀或成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞;(2)SH2(CD105)、CD44等呈陽(yáng)性表達(dá),而CD31、CD34、CD45等呈陰性表達(dá);(3)在不同誘導(dǎo)條件下可向多系定向分化。多向分化潛能和自我更新是干細(xì)胞的基本特點(diǎn)。因此,在本研究中,利用密度梯度離心及貼壁篩選法分離人骨髓血,培養(yǎng)出形態(tài)為成纖維樣、梭形的細(xì)胞;經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè),表達(dá)CD44和CD105,不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和白細(xì)胞表面抗原CD45。經(jīng)不同的誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo),可分別分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全符合目前所定義的體外培養(yǎng)的MSCs主要采用聯(lián)合鑒定方法,從而證實(shí)人骨髓中的MSCs易于體外分離培養(yǎng),且具有多向分化潛能,在不同的誘導(dǎo)體系下能分化成不同類型的組織細(xì)胞,可為骨組織工程學(xué)、心肌組織再生醫(yī)學(xué)中損傷組織的修復(fù)與治療提供自體來(lái)源細(xì)胞。
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