張 戟,楊 虹,李偉明,徐亞偉,魏毅東,王 勇,沈建穎,聞 靜,明 強

急性冠脈綜合征 (acute coronary syndromes,ACS)是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵蝕、繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎的一組臨床綜合征,ACS導致的致命性心肌梗死和猝死約占全球死亡人數的1/3[1]。細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的降解貫穿于動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)生發(fā)展的整個過程?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一組可降解ECM中分子成分的內肽酶家族,其中MMP-3是動脈粥樣硬化斑塊進展及破裂過程中的關鍵酶,可通過消化纖維帽成分破壞其結構而加速斑塊破裂,是造成斑塊不穩(wěn)定的重要原因之一。本研究對涉及影響ACS斑塊不穩(wěn)定性的MMP-3基因啟動子區(qū)域的5A/6A單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)進行了檢測,對ACS患者進行基因分型及病例-對照關聯分析,并對MMP-3在血清中表達水平進行分析,探討MMP-3血清水平及其基因啟動子區(qū)域的5A/6A單核苷酸多態(tài)性與ACS的相關性,同時分析吸煙是否在此基礎上對ACS具有協同影響的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 2007年10月至2008年12月于同濟大學附屬第十人民醫(yī)院心內科行冠狀動脈造影術檢查者,所有研究對象均在知情同意后參與研究。ACS組135(男92,女43)例,平均年齡 (67±10)歲 。均根據臨床缺血性胸痛的表現、心電圖的動態(tài)演變及血清心肌標志物濃度的動態(tài)改變,經冠狀動脈造影確診(至少一支心外膜下冠狀動脈或其主要分支狹窄≥50%者),診斷符合美國心臟學會和美國心臟病協會(ACC/AHA)的診斷標準[2]。對照組71(男43,女28)例,平均年齡 (64±11)歲,為同期冠狀動脈造影陰性(心外膜下冠狀動脈或其主要分支狹窄＜50%),經病史、體檢、心電圖等檢查無ACS表現。入選對象均為我國上海地區(qū)漢族人群,無血緣關系,除外腎病綜合征、肝腎功能不全、肝臟疾病、甲狀腺和腎上腺疾病等影響脂質代謝的疾病。

1.2 血液檢測指標 研究對象均于冠脈造影術前經橈動脈抽取動脈血檢測血清MMP-3濃度,其他血樣本為入院即刻或(和)禁食12 h后取外周靜脈血測定。血清MMP-3濃度以酶聯免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定(上海西唐生物科技有限公司)。DNA血樣以EDTA-K2抗凝,異丙醇抽提法提取人白細胞基因組DNA,適量雙蒸水溶解,核酸分析儀測定DNA濃度,-80℃保存。

1.3 PCR擴增樣本DNA目標片段 引物由上海生工公司合成,上游引物為5′-GAT TAC AGA CAT GGG TCA CA-3′,下游引物為 5′-T TT CAA TCA GGA CAA GAC GAA GT T T-3′。采用的PCR反應體系(50 μ l)中含 10 pmol/L的引物、0.2 mmol/L dNTPs、2 mmol/L MgCl2和 2 U Taq酶。擴增條件為:95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 30 s,35個循環(huán),最后在 72℃延伸10 min。

1.4 酶切反應 PCR最終產物長度為120 bp,使用XmnⅠ限制性內切酶進行酶切,在5A/5A純合子片段上有一個XmnⅠ的識別位點,5′-GAA(N)4TTC-3′內切酶可以將 PCR產物切為 97 bp與23 bp兩個片段,而6A/6A純合子則不能被酶切。剩余的PCR產物被用于測序鑒定序列。

1.5 PCR產物基因型分析 本研究根據Dunleavey等[3]的方法,在必要的修飾后進行MMP-3啟動子區(qū)域的基因型分析。于ABI 377型全自動測序儀上作DNA序列測定。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0軟件進行數據分析和統(tǒng)計。組間各臨床變量均數的差異比較采用t檢驗;不同基因型間MMP-3血清濃度比較用單因素方差分析;組間基因型、等位基因頻率比較用檢驗。相關疾病的等位基因和基因型風險率采用比值比(odds ratio,OR)表示,并進行危險度相關性分析。以對照組樣本計算,統(tǒng)計基因型為純合子和雜合子的期望頻數,并檢驗是否符合 Hardy-Winberg平衡。多因素分析采用logistic回歸模型分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組人群一般情況指標比較 ACS組平均年齡、性別構成、體質量指數與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);ACS組中有吸煙史、高血壓史及糖尿病史者也明顯多于對照組(P＜0.01)。ACS組血脂水平(總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇)及血清炎性標志物水平(C反應蛋白、纖維蛋白原)均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(均 P＜0.05;表1)。

表1 ACS組及對照組一般資料

2.2 PCR-RFLP檢測MMP-3多態(tài)性 應用PCR方法成功擴增到120 bp的特異性片段,產物作回收,純化,經限制性內切酶XmnⅠ酶切后,2.5%瓊脂糖凝膠電泳。部分樣本酶切結果見圖1。

圖1 2.5%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 ACS組和對照組基因頻率比較 MMP-3基因啟動子區(qū)5A/6A單核苷酸多態(tài)的基因型在ACS組和對照組中的分布有差異(P＜0.05),5A/5A型基因在ACS組高于對照組(P＜0.05),5A/6A型基因在ACS組高于對照組(P＜0.05)。其分布經檢驗符合Hardy-Weinberg平衡(表2)。

2.4 MMP-3基因多態(tài)性對ACS的發(fā)病危險度影響的分析 在ACS組中5A等位基因頻率高于對照組(P＜0.05),而且5A/5A+5A/6A基因型頻率亦高于對照組(OR=1.36,95%CI 1.08～1.72,P＜0.05;表 2)。

2.5 ACS各亞組間MMP-3血清濃度的比較ACS各亞組中血清MMP-3濃度均值都高于對照組〔n=71,(34±11)μ g/L〕,但不穩(wěn)定型心絞痛〔n=46,(37±13)μ g/L〕組與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。相對于對照組,非ST段抬高性心肌梗死組〔n=47,(42±14)μ g/L〕與ST段抬高性心肌梗死組〔n=42,(69±34)μ g/L〕的 MMP-3血清濃度均顯著升高(P＜0.01)。

2.6 ACS組MMP-3不同基因型組間血清MMP-3濃度的比較 ACS組5A/5A與5A/6A基因型組間血清MMP-3濃度比較有統(tǒng)計學差異〔(65±48)vs(47±22)μ g/L,P ＜0.05〕;ACS組 5A/5A+5A/6A與6A/6A基因型組間血清MMP-3濃度比較有統(tǒng)計學差異〔(52±32)vs(42±25)μ g/L,P ＜0.05〕。

2.7 多因素logistic回歸分析 將全體研究對象作為整體進行分析,以性別,吸煙,高脂血癥,糖尿病,高血壓,5A/5A+5A/6A作為自變量(X),有無ACS作為應變量(Y),進行多因素logistic回歸分析,分析發(fā)現吸煙、高脂血癥、糖尿病、高血壓為ACS的主要危險因子,5A/5A+5A/6A基因型(OR=2.11,95%CI 1.23～5.11,P＜0.01)亦是ACS發(fā)病的獨立危險因子(表3)。

表3 ACS各危險因子的多因子logistic回歸分析

2.8 MMP-3基因啟動子區(qū)5A/6A多態(tài)性與吸煙對ACS的危險度分析 同為不吸煙者,攜帶5A等位基因者較攜帶6A/6A基因者有較高的患ACS的風險,吸煙并攜帶6A/6A基因者較不吸煙攜帶6A/6A者有4倍的風險患ACS,而吸煙并攜帶5A等位基因者較不吸煙攜帶6A/6A者有5倍的ACS患病風險,且有顯著差異(P＜0.01;表4)。

3 討 論

從穩(wěn)定性冠心病轉變?yōu)槲＜吧腁CS的病理基礎,主要是動脈粥樣硬化斑塊破裂,引起血小板黏附、聚集,凝血因子激活和血栓形成,導致冠狀動脈完全或不完全阻塞[4],所以ACS的發(fā)生與冠狀動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關,尋找一種能更精確地了解斑塊性質、鑒別不穩(wěn)定斑塊的方法非常重要。相對于影像學檢查方法,探討ACS遺傳易感性的基因標志也是近年心血管領域的研究熱點[5]。在正常的動脈組織內檢測不到蛋白水解酶活性,但在動脈粥樣硬化斑塊,特別是不穩(wěn)定斑塊內MMP等蛋白水解酶的活性顯著升高,導致組成纖維帽的ECM降解,強度減小,這被認為是斑塊纖維帽變薄易破裂的主要原因。而抑制MMPs活性,可提高動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性,減少臨床事件的發(fā)生[6,7]。這些研究為冠狀動脈不穩(wěn)定性斑塊相關標志物的檢測提供了理論基礎,目前已經深入到分子生物學水平。

MMP是由23個酶組成的超家族,可以分為膠原酶、白明膠酶、基質分解酶、膜型基質蛋白酶及基質降解酶[8,9]。在分子結構上,各種MMP都具有五個功能域[10]:信號肽、前肽、催化區(qū)、鋅結合區(qū)及Pexin樣區(qū)。MMP-3屬MMP家族中基質溶素類的一種,又稱基質溶素-1(stromelysim-1),其基因位于11q22.2-22.3,作用底物廣泛,可以單獨降解構成 ECM的大部分成分,同時又可以激活 MMP-1、MMP-8、MMP-9 的活 性,共同 參與ECM的降解過程。Lancelot等[11]證實,MMP-3可在人頸動脈斑塊局部顯著表達。通過原位mRNA雜交,Henney等[12]發(fā)現冠狀動脈粥樣硬化斑塊中存在MMP-3,MMP-3高度局限于斑塊易破裂的纖維帽肩部。MMP-3可降解纖維帽的ECM,削弱纖維帽結構,使斑塊不穩(wěn)定,進而破裂,發(fā)生 ACS。

研究發(fā)現MMP-3基因啟動子區(qū)多態(tài)性可能以等位基因特異方式調節(jié)MMP-3基因的轉錄[13]。本研究涉及的MMP-3基因啟動子區(qū)域多態(tài)性于1995年首次由Ye等[13]報道。迄今發(fā)現其啟動子區(qū)域共有6個多態(tài)性位點[14],本研究中1612 5A/6A位于MMP-3啟動子區(qū)域,為該區(qū)域常見的多態(tài)性,即位于轉錄起始點上游1612 bp處含有5個一串阿糖腺苷(A)的等位基因或者含有6個一串阿糖腺苷(A)的等位基因。

有關MMP-3-1612 5A/6A多態(tài)性方面有一些遺傳流行性病學研究。有證據支持該多態(tài)性與多種心血管疾病相關[13]?？偟膩碚f,6A/6A基因型與增加基質蛋白合成的表型有關,而5A/5A及5A/6A基因型與增加基質蛋白分解的表型有關,6A/6A基因型有較高的冠狀動脈狹窄率,而5A/5A和5A/6A基

表4 MMP-3基因啟動子區(qū)5A/6A多態(tài)性與吸煙對ACS的危險度分析

因型者心肌梗死風險較高[15]。MMP-3-1612 5A/6A多態(tài)性位于白介素-1反應元件內。在體實驗研究報道,應用基因分型技術,發(fā)現5A等位基因啟動子與6A等位基因相比,具有更強的促基因表達的活性。在巨噬細胞、平滑肌細胞以及成纖維細胞中均可觀察到上述發(fā)現[14]。MMP-3在動脈粥樣硬化斑塊的基質蛋白降解中起重要作用。5A/5A和5A/6A基因型者心肌梗死風險較高,其可能原因是5A/5A或5A/6A基因型的MMP-3高表達使得粥樣斑塊進展成含基質蛋白少的斑塊,從而斑塊相對小且易于破裂(如富含脂質的斑塊),而6A/6A基因型的MMP-3表達水平低而易于使粥樣斑塊進展成富含基質蛋白的斑塊,斑塊相對大而穩(wěn)定(如纖維斑塊)。日本學者的研究發(fā)現攜帶5A等位基因是日本人群發(fā)生急性心肌梗死的獨立基因危險因子[16],與本研究結果相似。

從不同5A/6A多態(tài)性的基因型個體中分離的血管組織進行有關MMP-3 mRNA和蛋白的研究發(fā)現,5A純合子者MMP-3的水平最高,雜合子居中,6A純合子者MMP-3的水平最低[17]。這提示5A/6A多態(tài)性可影響在體MMP-3的轉錄,從而導致在不同MMP-3基因型個體中MMP-3水平的差異。循環(huán)中MMP-3水平受MMP-3基因啟動子區(qū)域5A/6A多態(tài)性的影響,急性心肌梗死發(fā)生與MMP-3基因啟動子區(qū)5A/6A多態(tài)性顯著相關。有研究提示,AMI及UA患者血清MMP-3濃度高于慢性穩(wěn)定型心絞痛患者及無冠心病的人群[18]。由于MMP-3高度表達常局限于斑塊易破裂的纖維帽肩部,ACS時常伴有動脈粥樣硬化斑塊纖維帽肩部的破裂,可能造成MMP-3釋放入血,使循環(huán)水平MMP-3升高。在本研究中,ACS組血清MMP-3濃度高于對照組(P＜0.01)。ACS亞組中AMI組血清MMP-3濃度均值都高于對照組,但UA組與對照組的MMP-3水平比較無統(tǒng)計學差異,可能由于UA組患者斑塊較AMI患者相對穩(wěn)定,MMP-3釋放入血相對較少,其循環(huán)水平相對較低,此外,UA亞組樣本相對較小也是無統(tǒng)計學差異可能的原因。所以,MMP-3的循環(huán)水平升高常提示斑塊破裂,與ACS尤其是AMI的發(fā)生密切相關,在今后ACS的診斷和治療中應充分重視MMP-3的作用。

有研究結果與上述觀點不一致,雖然也發(fā)現MMP-3-1612 5A/6A多態(tài)性與MMP-3血清濃度呈強相關,但卻認為6A等位基因單拷貝或雙拷貝與血清MMP-3的濃度增加有關;而且僅在女性患者中,血清MMP-3濃度與斑塊面積呈負相關(r=-0.39,P ＜0.05)[19]。

本研究進行多因素logistic回歸分析發(fā)現吸煙、高脂血癥、糖尿病、高血壓為ACS的主要危險因素,5A/5A+5A/6A基因型(OR=2.11,95%CI 1.23～5.11,P＜0.01)亦是ACS發(fā)病的獨立危險因素,提示MMP-3可能對動脈粥樣硬化斑塊的破裂具有重要的作用。

吸煙是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的危險因素之一,本研究在ACS的隊列研究中發(fā)現吸煙與MMP-3基因多態(tài)性這一基因-環(huán)境因素協同影響ACS的發(fā)生。不吸煙攜帶5A等位基因者較不吸煙攜帶6A/6A基因者有較高的ACS發(fā)病的風險;吸煙并攜帶6A/6A基因者較不吸煙攜帶6A/6A者有4倍的風險患ACS;而吸煙并攜帶5A等位基因者較不吸煙攜帶6A/6A者有5倍的ACS發(fā)病風險。炎癥的機制可能解釋吸煙并攜帶5A等位基因者ACS高風險的原因。另有研究證實可替寧和尼古丁直接影響MMP-3及其他MMPs基因的表達[20],而5A等位基因影響MMP-3的活性,增加血管內斑塊的易損性,導致斑塊破裂,引起ACS的發(fā)生。

本研究提示MMP-3可能對動脈粥樣硬化斑塊的破裂具有重要的作用。臨床檢測MMP-3血清濃度對診斷ACS具有一定的實用價值,血清MMP-3可作為ACS輔助診斷的心臟標志物。

[1]Langer HF,Haubner R,Pichler BJ,et al.Radionuclide imaging:a molecular key to the atherosclerotic plaque[J].J Am Coll Cardiol,2008,52(1):1-12.

[2]Topol EJ,Califf RM,Prystowsky EN,et al.Textbook of Cardiovascular Medicine[M].3rd ed.Philadelphia:Lippincot Williams&Wilkins,2007:1628.

[3]Dunleavey L,Beyzade S,Ye S.Rapid genotype analysis of the stromelysingene 5A/6A polymorphism[J].Atherosclerosis,2000,151(2):587-589.

[4]Davi G,Patrono C.Platelet activation and atherothrombosis[J].N Engl J Med,2007,357(24):2482-2494.

[5]Burzotta F,Leone AM,Paciaroni K,et al.G20210A prothrombin gene variant and clinical outcome in patients with a firstacute coronary syndrome[J].Haematologiea,2004,89(9):1134-1138.

[6]Nambi V,Morrison AC,Hooqeveen RC,et al.Matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitors do not predict incident coronary artery disease in the Atherosclerosis Risk In Communities(ARIC)study[J].Tex Heart Inst J,2008,35(4):388-394.

[7]Chang CJ,Hsu LA,Ko YH,et al.Thrombin regulates matrix metalloproteinase-9 expression in human monocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,385(2):241-246.

[8]Newby AC.Metalloproteinases and vulnerable atherosclerotic plaques[J].Trends Cardiovasc Med,2007,17(8):253-258.

[9]Ii H,Hontani N,Toshida I,et al.Group IVA phospholipase A2-associated production of MMP-9 in macrophages and formation of atherosclerotic lesions[J].Biol Pharm Bull,2008,31(3):363-368.

[10]Tayebjee MH,Lip GY,MacFadyen RJ.Matrix metalloproteinases incoronary artery disease:clinical and therapeutic implications and pathological significance[J].Curr Med Chem,2005,12(8):917-925.

[11]Lancelot E,Amirbekian V,Briggern I,etal.Evaluation of matrix metalloproteinases in atherosclerosis using a novel noninvasive imaging approach[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(3):425-432.

[12]Henney AM,Wakeley PR,Davies MJ,et al.Location of stromelysin gene expresson in atherosclerotic plaque by in situ hybridization[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(18):8154-8158.

[13]Ye S.Influence of matrix metalloproteinase genotype on cardiovascular disease susceptibility and outcome[J].Cardiovasc Res,2006,69(3):636-645.

[14]Beyzade S,Zhang S,Wong YK,et al.Influences of matrix metalloproteinase-3 gene variation on extent of coronary atherosclerosis and risk of myocardialinfarction[J].JAm Coll Cardiol,2003,41(12):2130-2137.

[15]Schwarz A,Haberbosch W,Tillmanns H,et al.The stromelysin-1 5A/6A promoter polymorphism is a disease marker for the extent of coronary heart disease[J].Dis Markers,2002,18(3):121-128.

[16]Nojiri T,Morita H,Imai Y,etal.Genetic variations of matrix metalloproteinase-1 and-3 promoter regions and their associations with susceptibility to myocardial infarction in Japanese[J].Int J Cardiol,2003,92(2-3):181-186.

[17]Medley TL,Kingwell BA,Gatzka CD,et al.Matrix metalloproteinase-3 genotype contributes to age-related aortic stiffening through modulation of gene and protein expression[J].Circ Res,2003,92(11):1254-1261.

[18]Yan J,Wu Z,Kong X,et al.Relation between upregulation of CD40 system and complex stenosis morphology in patients with acute coronary syndrome[J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(2):251-256.

[19]Samnegard RD,Sliveira A,Lundman P,et al.Serum matrix metalloproteinase-3 concentration is influenced by MMP-3-1612 5A/6A promoter genotype and associated with myocardial infarction[J].J Intern Med,2005,258(5):411-419.

[20]Carty CS,Soloway PD,Kayastha S,et al.Nicotine and cotinine stimulate secretion of basic fibroblast growth factor and affect expression of matrix metalloproteinases in cultured human smooth muscle cells[J].J Vasc Surg,1996,24(6):927-934.