楊牧祥 張一昕 于文濤 徐華洲 高 瑋 韓 雪

河北醫(yī)科大學中醫(yī)學院(石家莊050091)

1 材料

1.1 實驗動物清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量

180～200g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供，動物合格證號:SCXK(鄂)2004-007。

1.2 藥物柔肝消飲組成:由香附、青皮、炙黃芪、炒白術、白芍、三棱、莪術、地鱉蟲、郁金、姜黃、丹參等藥物組成，水煎濃縮成所需濃度的藥液。復方鱉甲軟肝片:由內蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產，批號國藥準字Z19991011，實驗時用蒸餾水配制成所需濃度的藥液。

1.3 主要試劑Leptin試劑盒購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司;Trizol RNA試劑盒購自美國Invitrogen公司;PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。Leptin的引物由北京塞百盛基因技術有限公司合成，以β-actin為內參照。Leptin的上游引物為5'-CCTGTGGCTTTGGTCCTATCTG-3';下游引物為5'-CTGCTCAGAGCCACCACCTCTG-3'，擴增片段為420bp。β-actin上游引物為5'-CCA AGGCCA ACCGCGAGA AGATGA C-3'，下游引物為5'-AGGGTACATGGTGGT GGCGCCAGAC-3'，擴增片斷長度為577bp。

1.4 主要儀器756MC型紫外-可見分光光度計、PE9600型PCR擴增儀、電泳儀及電泳槽、凝膠圖像分析系統、紫外透射儀、超低溫保存箱、高速冷凍離心機等。

2 方法

2.1 模型制備60只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為造模組48只和正常組12只。參照文獻［5-6］，48只造模組大鼠首次予皮下注射40%CCl4花生油溶液(0.5mL/100g體質量)，以后每周2次皮下注射(0.3mL/100g體質量)，共9周。造模開始前2周均以20%豬油、0.5%膽固醇、79.5%玉米面混合飼料(由河北醫(yī)科大學動物實驗中心加工)喂養(yǎng)，第3～9周以0.5%膽固醇和99.5%玉米面混合飼料(由河北醫(yī)科大學動物實驗中心加工)喂養(yǎng)。整個造模期間以30%乙醇作為飲料讓大鼠自由飲用。正常組則以正常飼料和純凈水喂養(yǎng)。實驗第9周末，確認造模成功后予以分組治療。

2.2 分組與治療造模成功后，正常組隨機抽取大鼠10只，將造模成功大鼠隨機抽取40只，并分為4組，每組10只，雌雄各半。即:正常組，灌服生理鹽水;模型組，灌服生理鹽水;柔肝消

2.3 動物取材治療4周末，于最后1次給藥后禁食12h，麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血，3500r/min離心5min，分離血清待檢。同時切開腹部迅速剖取肝臟，一部分液氮冷凍，一部分用4%多聚甲醛固定。

2.4 指標檢測

2.4.1 肝組織病理形態(tài)學觀察取用4%多聚甲醛固定的大鼠肝組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。

2.4.2 血清Leptin的檢測采用放免法，嚴格按照試劑盒說明操作。

2.4.3 RT-PCR法測定大鼠肝LeptinmRNA表達 (1)采用Trizol提取總RNA，然后測定RNA樣品含量及純度:A260/A280=1.8～2.0間方可使用。(2)RT反應:取總 RNA 2μg，加入RT 反應體系(含 AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Primer，AMV，Rnase Inhibitor等)管中，并用DEPC處理水補足到50μL反應液體積，震蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀50℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。-20℃保存?zhèn)溆谩?3)PCR反應:50μL反應體系含Taq DNA聚合酶、dNTPs、上樣染料、穩(wěn)定劑、優(yōu)化劑、反應緩沖液、逆轉錄反應產物、上下游引物等。震蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀擴增。反應條件:變性94℃，30s，退火 61℃，30s，延伸 72℃，30s，30 個循環(huán)，最后延伸 10min。(4)半定量分析:取每個標本的擴增產物6μL于1%的含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標準分子量標記，電泳后于紫外透射儀觀察，并用數碼相機照相，輸入微機應用法國VL公司BIO-PROFIF凝膠圖像分析系統對目的電泳條帶進行分析，以相應的內參電泳條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度的比值表示。

2.5 統計學處理數據以(±s)表示，運用SPSS 11.5統計軟件，采用方差分析、Student-Newman-Keul檢驗。

3 結果

3.1 肝組織病理形態(tài)學改變正常組大鼠肝組織結構完整、清晰，肝小葉結構正常，肝細胞排列規(guī)則成索狀，在中央靜脈周圍呈放射狀分布。肝血竇結構清晰，無異常改變。肝細胞呈多邊形，胞漿均勻，細胞核形態(tài)正常。模型組大鼠肝小葉正常結構消失，間質內彌漫性淋巴細胞浸潤。肝細胞體積明顯增大，局部肝細胞出現嚴重的脂肪變性，可見到再生的肝細胞(雙核)。肝間質廣泛纖維組織增生，將正常肝小葉分割成大小不等的肝細胞團(即假小葉形成)。高劑量組大鼠肝小葉結構輕度受損，少數肝細胞氣泡樣變性，偶見壞死細胞，較少炎性細胞浸潤，少量纖維組織增生，但未見形成間隔。低劑量組肝小葉結構被破壞，部分肝細胞氣泡樣變性并伴有細胞壞死，較多淋巴、單核細胞浸潤，纖維組織增生，但較少形成間隔。陽性藥對照組與低劑量組基本相似。

見表1。與正常組相比，模型組大鼠血清Leptin的含量異常升高 (P＜0.01)，給藥后，各治療組均能顯著降低血清Leptin的含量(P＜0.01)，且柔肝消飲高劑量組Leptin的含量低于低劑量組和對照組(P＜0.01)，而柔肝消飲低劑量組與陽性藥對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

見表1、圖1、圖2。RT-PCR后，瓊脂糖凝膠電泳，在420bp、577bp處分別顯示出Leptin和β-actin電泳帶，與預期結果一致。模型組大鼠Leptin mRNA的表達顯著高于正常組 (P＜0.01)。給藥后，各治療組Leptin mRNA的表達顯著低于模型組(P ＜0.01)，柔肝消飲高劑量組Leptin mRNA的表達低于柔肝消飲低劑量組和陽性藥對照組(P＜0.05)，而柔肝消飲低劑量組與陽性藥對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清Leptin含量和肝組織Leptin mRNA的表達情況(±s)

表1 各組大鼠血清Leptin含量和肝組織Leptin mRNA的表達情況(±s)

與模型組比較，＊P＜0.01;與陽性藥對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與柔肝消飲高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別正常組模型組柔肝消n飲高劑量組柔肝消飲低劑量組陽性藥對照組10 10 10 10 10 Leptin(ng/mL)0.54±0.09＊2.08±0.29 0.99±0.14＊△△1.38±0.25＊▲▲1.52±0.19＊Leptin/β-actin mRNA 0.285±0.023＊1.212±0.109 0.649±0.594＊△0.818±0.123＊▲0.857±0.114＊

圖1

圖2

4 討論

Leptin是由肥胖基因編碼的一種多肽類激素，除全身的脂肪組織外，肝臟、胃黏膜、胎盤、胎兒心臟、骨骼肌、骨及軟骨組織等均可以分泌Leptin［7］。Letin受體分布廣泛，是一種多靶器官、多功能的激素，具有廣泛的生物學效應，它參與糖、脂肪及能量代謝的調節(jié)，促使機體攝食減少，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成，抑制胰島素的分泌［8］。自 Potter等［9］發(fā)現活化的肝星狀細胞(HSCs)中Leptin mRNA和蛋白質合成增加之后，Leptin與肝臟疾病的關系逐漸引起重視。大量動物實驗證明，瘦素可通過調節(jié)HSC對細胞因子及膠原的表達促進肝纖維化進程［10］。Bolukbas等［11］發(fā)現進展期肝病患者的血清Leptin水平明顯升高。近年來研究顯示:慢性肝病時激活的HSCs產生Leptin，Leptin又進一步促進HSCs的增殖與活化，導致Letin水平明顯升高。Leptin通過與庫普弗細胞、SECs上的瘦素受體結合，提高庫普弗細胞、肝竇內皮細胞中細胞因子TGF-β1的表達，導致膠原的大量產生及肝硬化的形成［4］。

肝硬化根據臨床表現可歸屬于中醫(yī)學“脅痛”、“積聚”、“臌脹”等范疇。中醫(yī)學認為本病多由酒食不節(jié)，損傷脾胃，脾失健運，壅阻氣機，肝失條達，氣血郁滯，或情志抑郁，肝失疏泄，氣郁日久，血流不暢，瘀血停積，脅絡痹阻所致。其病位在肝脾兩臟，主要病機為肝郁脾虛、氣滯血瘀。故當以疏肝健脾，行氣活血，逐瘀消為主要治法。課題組經多年臨床觀察，精心篩選相關藥物組成“柔肝消飲”。方中香附、青皮疏肝理氣，炙黃芪、炒白術健脾益氣，四藥相合，共達抑肝扶脾之效;炙黃芪、炒白術益氣健脾;三棱、莪術、地鱉蟲、丹參、郁金、姜黃破血行氣，逐瘀消;白芍養(yǎng)血柔肝，既可助香附、青皮疏肝解郁之力，又可防止破血太過之弊;諸藥合用，共奏疏肝健脾，行氣活血，逐瘀消之功效。

本實驗研究表明，模型組大鼠血清Leptin含量異常升高，肝臟Leptin mRNA表達明顯增強(P＜0.01)，顯示肝硬化的發(fā)生與發(fā)展與Leptin的分泌與釋放有密切關系。經過治療，各治療組大鼠血清Leptin含量明顯降低，肝臟Leptin表達減弱，說明柔肝消飲通過抑制HSCs分泌Leptin，以達到抗肝硬化的作用，這可能是其治療肝硬化的分子機制之一。

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