楊牧祥 張一昕 于文濤 徐華洲 高 瑋 韓 雪

河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院(石家莊050091)

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量

180～200g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(鄂)2004-007。

1.2 藥物柔肝消飲組成:由香附、青皮、炙黃芪、炒白術(shù)、白芍、三棱、莪術(shù)、地鱉蟲(chóng)、郁金、姜黃、丹參等藥物組成，水煎濃縮成所需濃度的藥液。復(fù)方鱉甲軟肝片:由內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字Z19991011，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配制成所需濃度的藥液。

1.3 主要試劑Leptin試劑盒購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司;Trizol RNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司。Leptin的引物由北京塞百盛基因技術(shù)有限公司合成，以β-actin為內(nèi)參照。Leptin的上游引物為5'-CCTGTGGCTTTGGTCCTATCTG-3';下游引物為5'-CTGCTCAGAGCCACCACCTCTG-3'，擴(kuò)增片段為420bp。β-actin上游引物為5'-CCA AGGCCA ACCGCGAGA AGATGA C-3'，下游引物為5'-AGGGTACATGGTGGT GGCGCCAGAC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為577bp。

1.4 主要儀器756MC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、PE9600型PCR擴(kuò)增儀、電泳儀及電泳槽、凝膠圖像分析系統(tǒng)、紫外透射儀、超低溫保存箱、高速冷凍離心機(jī)等。

2 方法

2.1 模型制備60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為造模組48只和正常組12只。參照文獻(xiàn)［5-6］，48只造模組大鼠首次予皮下注射40%CCl4花生油溶液(0.5mL/100g體質(zhì)量)，以后每周2次皮下注射(0.3mL/100g體質(zhì)量)，共9周。造模開(kāi)始前2周均以20%豬油、0.5%膽固醇、79.5%玉米面混合飼料(由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心加工)喂養(yǎng)，第3～9周以0.5%膽固醇和99.5%玉米面混合飼料(由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心加工)喂養(yǎng)。整個(gè)造模期間以30%乙醇作為飲料讓大鼠自由飲用。正常組則以正常飼料和純凈水喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第9周末，確認(rèn)造模成功后予以分組治療。

2.2 分組與治療造模成功后，正常組隨機(jī)抽取大鼠10只，將造模成功大鼠隨機(jī)抽取40只，并分為4組，每組10只，雌雄各半。即:正常組，灌服生理鹽水;模型組，灌服生理鹽水;柔肝消

2.3 動(dòng)物取材治療4周末，于最后1次給藥后禁食12h，麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈取血，3500r/min離心5min，分離血清待檢。同時(shí)切開(kāi)腹部迅速剖取肝臟，一部分液氮冷凍，一部分用4%多聚甲醛固定。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察取用4%多聚甲醛固定的大鼠肝組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

2.4.2 血清Leptin的檢測(cè)采用放免法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

2.4.3 RT-PCR法測(cè)定大鼠肝LeptinmRNA表達(dá) (1)采用Trizol提取總RNA，然后測(cè)定RNA樣品含量及純度:A260/A280=1.8～2.0間方可使用。(2)RT反應(yīng):取總 RNA 2μg，加入RT 反應(yīng)體系(含 AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Primer，AMV，Rnase Inhibitor等)管中，并用DEPC處理水補(bǔ)足到50μL反應(yīng)液體積，震蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀50℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。-20℃保存?zhèn)溆谩?3)PCR反應(yīng):50μL反應(yīng)體系含Taq DNA聚合酶、dNTPs、上樣染料、穩(wěn)定劑、優(yōu)化劑、反應(yīng)緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物、上下游引物等。震蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件:變性94℃，30s，退火 61℃，30s，延伸 72℃，30s，30 個(gè)循環(huán)，最后延伸 10min。(4)半定量分析:取每個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物6μL于1%的含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，電泳后于紫外透射儀觀察，并用數(shù)碼相機(jī)照相，輸入微機(jī)應(yīng)用法國(guó)VL公司BIO-PROFIF凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以?xún)烧咧e分吸光度的比值表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以(±s)表示，運(yùn)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析、Student-Newman-Keul檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)改變正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列規(guī)則成索狀，在中央靜脈周?chē)史派錉罘植?。肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)異常改變。肝細(xì)胞呈多邊形，胞漿均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常。模型組大鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，間質(zhì)內(nèi)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。肝細(xì)胞體積明顯增大，局部肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性，可見(jiàn)到再生的肝細(xì)胞(雙核)。肝間質(zhì)廣泛纖維組織增生，將正常肝小葉分割成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)(即假小葉形成)。高劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)輕度受損，少數(shù)肝細(xì)胞氣泡樣變性，偶見(jiàn)壞死細(xì)胞，較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量纖維組織增生，但未見(jiàn)形成間隔。低劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，部分肝細(xì)胞氣泡樣變性并伴有細(xì)胞壞死，較多淋巴、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，但較少形成間隔。陽(yáng)性藥對(duì)照組與低劑量組基本相似。

見(jiàn)表1。與正常組相比，模型組大鼠血清Leptin的含量異常升高 (P＜0.01)，給藥后，各治療組均能顯著降低血清Leptin的含量(P＜0.01)，且柔肝消飲高劑量組Leptin的含量低于低劑量組和對(duì)照組(P＜0.01)，而柔肝消飲低劑量組與陽(yáng)性藥對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

見(jiàn)表1、圖1、圖2。RT-PCR后，瓊脂糖凝膠電泳，在420bp、577bp處分別顯示出Leptin和β-actin電泳帶，與預(yù)期結(jié)果一致。模型組大鼠Leptin mRNA的表達(dá)顯著高于正常組 (P＜0.01)。給藥后，各治療組Leptin mRNA的表達(dá)顯著低于模型組(P ＜0.01)，柔肝消飲高劑量組Leptin mRNA的表達(dá)低于柔肝消飲低劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組(P＜0.05)，而柔肝消飲低劑量組與陽(yáng)性藥對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清Leptin含量和肝組織Leptin mRNA的表達(dá)情況(±s)

表1 各組大鼠血清Leptin含量和肝組織Leptin mRNA的表達(dá)情況(±s)

與模型組比較，＊P＜0.01;與陽(yáng)性藥對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與柔肝消飲高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別正常組模型組柔肝消n飲高劑量組柔肝消飲低劑量組陽(yáng)性藥對(duì)照組10 10 10 10 10 Leptin(ng/mL)0.54±0.09＊2.08±0.29 0.99±0.14＊△△1.38±0.25＊▲▲1.52±0.19＊Leptin/β-actin mRNA 0.285±0.023＊1.212±0.109 0.649±0.594＊△0.818±0.123＊▲0.857±0.114＊

圖1

圖2

4 討論

Leptin是由肥胖基因編碼的一種多肽類(lèi)激素，除全身的脂肪組織外，肝臟、胃黏膜、胎盤(pán)、胎兒心臟、骨骼肌、骨及軟骨組織等均可以分泌Leptin［7］。Letin受體分布廣泛，是一種多靶器官、多功能的激素，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，它參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào)節(jié)，促使機(jī)體攝食減少，增加能量釋放，抑制脂肪細(xì)胞的合成，抑制胰島素的分泌［8］。自 Potter等［9］發(fā)現(xiàn)活化的肝星狀細(xì)胞(HSCs)中Leptin mRNA和蛋白質(zhì)合成增加之后，Leptin與肝臟疾病的關(guān)系逐漸引起重視。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，瘦素可通過(guò)調(diào)節(jié)HSC對(duì)細(xì)胞因子及膠原的表達(dá)促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程［10］。Bolukbas等［11］發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期肝病患者的血清Leptin水平明顯升高。近年來(lái)研究顯示:慢性肝病時(shí)激活的HSCs產(chǎn)生Leptin，Leptin又進(jìn)一步促進(jìn)HSCs的增殖與活化，導(dǎo)致Letin水平明顯升高。Leptin通過(guò)與庫(kù)普弗細(xì)胞、SECs上的瘦素受體結(jié)合，提高庫(kù)普弗細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)，導(dǎo)致膠原的大量產(chǎn)生及肝硬化的形成［4］。

肝硬化根據(jù)臨床表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”、“積聚”、“臌脹”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病多由酒食不節(jié)，損傷脾胃，脾失健運(yùn)，壅阻氣機(jī)，肝失條達(dá)，氣血郁滯，或情志抑郁，肝失疏泄，氣郁日久，血流不暢，瘀血停積，脅絡(luò)痹阻所致。其病位在肝脾兩臟，主要病機(jī)為肝郁脾虛、氣滯血瘀。故當(dāng)以疏肝健脾，行氣活血，逐瘀消為主要治法。課題組經(jīng)多年臨床觀察，精心篩選相關(guān)藥物組成“柔肝消飲”。方中香附、青皮疏肝理氣，炙黃芪、炒白術(shù)健脾益氣，四藥相合，共達(dá)抑肝扶脾之效;炙黃芪、炒白術(shù)益氣健脾;三棱、莪術(shù)、地鱉蟲(chóng)、丹參、郁金、姜黃破血行氣，逐瘀消;白芍養(yǎng)血柔肝，既可助香附、青皮疏肝解郁之力，又可防止破血太過(guò)之弊;諸藥合用，共奏疏肝健脾，行氣活血，逐瘀消之功效。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，模型組大鼠血清Leptin含量異常升高，肝臟Leptin mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，顯示肝硬化的發(fā)生與發(fā)展與Leptin的分泌與釋放有密切關(guān)系。經(jīng)過(guò)治療，各治療組大鼠血清Leptin含量明顯降低，肝臟Leptin表達(dá)減弱，說(shuō)明柔肝消飲通過(guò)抑制HSCs分泌Leptin，以達(dá)到抗肝硬化的作用，這可能是其治療肝硬化的分子機(jī)制之一。

［1］楊牧祥，張一昕，王少賢，等.柔肝消飲對(duì)肝硬化大鼠肝功能的影響［J］. 中醫(yī)藥通報(bào)，2007，6(3):58-59.

［2］楊牧祥，張一昕，王少賢，等.柔肝消飲對(duì)肝硬化大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)和肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 ［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2008，18(1):38-42.

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