汪瑩,高東明,許棟明,王文,艾厚喜,張麗,李林

腦卒中是影響人類健康的三大疾病之一,嚴(yán)重地威脅著人們的身體健康和生活質(zhì)量。在腦缺血早期,自由基損傷、興奮性神經(jīng)毒性和反復(fù)細(xì)胞膜去極化導(dǎo)致能量衰竭,引起級聯(lián)式“瀑布反應(yīng)”,破壞了“神經(jīng)血管單元”(neurovascular unit)穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡以及微血管、血腦屏障破壞[1]。中藥在治療腦卒中方面有顯著的臨床療效。莫諾苷是從中藥山茱萸中篩選出的有效成分。前期研究發(fā)現(xiàn),莫諾苷對SY5Y神經(jīng)細(xì)胞具有抑制過氧化氫損傷、抑制細(xì)胞凋亡、鈣超載等作用[2-10],可提高局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層總抗氧化能力[11],抑制氧化應(yīng)激損傷,從而在基因表達(dá)水平上減少caspase-3的產(chǎn)生[12]。本試驗進(jìn)一步研究莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠caspase-3活化程度的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 莫諾苷由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物室從山茱萸中提取制備,HPLC分析純度大于98.5%。維生素E:北京雙鶴藥業(yè)。caspase-3活性檢測試劑盒(caspase-3 Activity Assay Kit):碧云天生物技術(shù)研究所(產(chǎn)品編號:C1116)。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物分組及給藥 36只SPF級Wistar雄性成年大鼠,體重260～280 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證編號:SCXK(京)2006-0009。隨機(jī)分為:假手術(shù)組,模型組,莫諾苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)劑量組和維生素E(35 mg/kg)組,每組6只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,術(shù)后連續(xù)灌胃給藥3 d,每天給藥1次,其中假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.3 模型制備 局灶性腦缺血再灌注模型采用改良Zea Longa線栓法[13]制備。大鼠用 10%水合氯醛0.35 ml/kg腹腔注射麻醉,仰臥位固定于鼠板上,頸部正中切口,鈍性分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA),結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈的近心端,動脈夾與頸總動脈近心端之間結(jié)扎一道縫合線,不扎緊。在頸總動脈接近頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處用眼科剪做一斜行細(xì)切口,將直徑為0.26 mm的尼龍線插入,稍扎緊縫合線,推動尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動脈,至距頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處約2 cm時,會有阻擋感,說明栓線已越過大腦中動脈(MCA),到達(dá)大腦前動脈(ACA)的起始部。記錄栓塞開始時間,結(jié)扎頸總動脈上端?？p合肌肉、皮膚。栓塞后30 min,若此時大鼠已蘇醒則需要再次將大鼠麻醉,并拔出尼龍線。假手術(shù)組的大鼠除不插入尼龍線外,飲食等其他操作與手術(shù)組相同。

1.4模型成功及評價標(biāo)準(zhǔn) 參照Longa及Bederon的5分制評分方法[13-14]對實驗動物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。將0分、1分及4分大鼠剔除,并補(bǔ)充各組設(shè)計所需大鼠數(shù)量。

1.5 caspase-3活性檢測 腦缺血再灌注后72 h迅速斷頭取腦,冰生理鹽水快速漂洗,徹底去除標(biāo)本表面血液后,于冰盤上分離缺血側(cè)腦組織。將大鼠缺血側(cè)海馬組織在電子天平上稱重后,按照每10 mg組織加入100 μ l裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿;把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中,冰浴再裂解5 min后,4℃、15000 g離心15 min。caspase-3活性檢測按照試劑盒說明書操作要求進(jìn)行,同時取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度,并按試劑盒提供的酶活力單位定義進(jìn)行換算。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組相比,模型組caspase-3活性顯著上升(P ＜0.001);服用莫諾苷 30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg后,活性呈劑量依賴下降(P＜0.05);服用維生素E后,caspase-3活性顯著降低(P＜0.001)。見表1。

表1 各組caspase-3活性比較(U)

3 討論

腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)在缺血性腦血管的病理生理過程起著重要的作用。腦梗死后超早期溶栓治療是恢復(fù)腦血流,挽救缺血腦組織的最佳方案;但血液再灌注會導(dǎo)致嚴(yán)重的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。近年來研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注損傷過程與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系,凋亡機(jī)制參與腦缺血再灌注損傷已成為臨床研究的熱點。

凋亡機(jī)制涉及一組半胱氨酸蛋白酶家族,稱為caspases。caspase家族是一大類凋亡的調(diào)控因子,是細(xì)胞凋亡的啟動者和最后的執(zhí)行者。研究表明,在caspase家族中,caspase-3是caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶[15-16]。它在正常細(xì)胞中以酶原形式存在,也稱Pro-caspase-3;當(dāng)受到凋亡刺激因素(缺血、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等)作用后,caspase-3前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽,然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基,并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體即活化caspase-3,從而形成酶的活化形式并作為凋亡的效應(yīng)分子執(zhí)行凋亡過程?；罨腸aspase-3可以激活核因子、細(xì)胞骨架蛋白及DNA裂解酶等,引起細(xì)胞形態(tài)的變化,如出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、DNA裂解、染色質(zhì)濃縮和凋亡小體的形成等,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase-3在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用。

活化的caspase-3作為凋亡最終的主要執(zhí)行者,其活性的變化間接反映組織細(xì)胞損傷的程度。已有實驗通過Western blot的方法證明莫諾苷可在基因水平上減少Pro-caspase-3的產(chǎn)生[12],即降低酶原的產(chǎn)生。本實驗利用分光光度法對caspase-3的活性進(jìn)行檢測,結(jié)果表明莫諾苷能夠抑制腦缺血再灌注損傷后腦組織中caspase-3活性的升高。結(jié)合已有研究[7,12],我們推測莫諾苷可能對caspase-3的基因表達(dá)和caspase-3蛋白酶的激活均有抑制作用,減少腦缺血再灌注后腦組織中caspase-3的表達(dá)與激活,從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,達(dá)到對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

莫諾苷在動物實驗中表現(xiàn)出明顯的抗凋亡能力,能抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠caspase-3的活化。其神經(jīng)保護(hù)作用值得進(jìn)一步研究探討。

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