吳彬，金露，王小同，任惠明

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 腦科、康復(fù)中心，浙江 溫州 325027)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發(fā)病率近年來(lái)不斷上升，每年約有250萬(wàn)人死于COPD，已經(jīng)成為威脅人類生命的第5大死因[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在慢性低氧高二氧化碳條件下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物認(rèn)知功能發(fā)生損害[2]。但是引起認(rèn)知功能障礙的病理生理機(jī)制目前尚未十分清楚，神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是慢性低氧高二氧化碳導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之一[3]。此外，慢性低氧高二氧化碳還可引起老鼠神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞水腫和海馬部位細(xì)胞因子表達(dá)異常[3-5]。線粒體是“細(xì)胞能量工廠”，其主要功能是將有機(jī)物氧化產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為ATP，是有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，對(duì)細(xì)胞的增殖、衰老、凋亡有著至關(guān)重要的作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)采用慢性低氧高二氧化碳小鼠模型，探討慢性低氧高二氧化碳對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大腦線粒體功能的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 C57BL/6小鼠，SPF級(jí)30只，雄性，7～9月齡，約28 g（溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成2組，每組15只：分為A組（低氧高二氧化碳組）和B組（正常對(duì)照組）。A組置于低氧高二氧化碳艙中(吸入氣O2濃度為9%～11%，CO2濃度為5%～6%)，每天8 h每周6 d，持續(xù)4周；其余時(shí)間與B組生活在同一室內(nèi)(室溫22～26 ℃，相對(duì)濕度50%～70%)。為了使A組動(dòng)物能適應(yīng)，每次O2濃度從21%降至10%的時(shí)間控制在15～20 min，CO2濃度升高至5%的時(shí)間控制在30 min。B組小鼠吸入空氣，其他條件與A組相同。

1.3 取材和方法

1.3.1 取材及SOD，GSH測(cè)定：直接用頸椎脫臼法處死，斷頭剝離顱骨，完整取出腦組織，置于冰盤上，去除腦干和小腦，沿矢狀裂將腦組織一分為二。用腦組織勻漿測(cè)量其SOD，GSH含量（具體按照南京建成提供的說(shuō)明書操作）。

1.3.2 腦組織線粒體的提取：采用差速離心法分離提取腦組織線粒體。取腦組織立即放入4 ℃新配制的分離介質(zhì)（含0.25 mol/L sucrose、0.1 mol/L Tris-Hcl、0.01 mol/L EDTA，pH 7.4），反復(fù)清洗3次，洗凈血跡、稱重，加入少量分離介質(zhì)，將組織充分剪碎至肉糜狀，分離介質(zhì)調(diào)整至原體積3倍，用玻璃勻漿器手動(dòng)勻漿，再將勻漿液調(diào)整至原體積8倍，1000×g、4 ℃低溫離心10 min，取上清液，7000×g、4 ℃低溫離心15 min，棄上清液，沉淀物加入1 mL線粒體緩沖液（含0.25 mol/L sucrose、0.1 mol/L Tris-Hcl，pH 7.4），整個(gè)提取過(guò)程均在冰浴中(0～4 ℃)進(jìn)行。所提取的線粒體混勻后，在-80 ℃冰箱中保存待用，1周內(nèi)檢測(cè)。

1.4 線粒體電鏡觀察 組織塊經(jīng)2.5%戊二醛固定后，PBS清洗，鋨酸固定，再次PBS清洗，依次脫水（70%丙酮、80%丙酮、90%丙酮、100%丙酮）；環(huán)氧丙烷浸透，EPON812包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)切片，常規(guī)染色，H-600型透射電鏡觀察腦組織神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞核和線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.5 腦組織腺苷酸的提取 斷頭后直接經(jīng)液氮冷凍，再剝離出大腦；加入1.8 mL預(yù)冷的0.3 mol/L高氯酸，用研缽冰浴中迅速勻漿；充分勻漿后，勻漿液8000 r/min，4 ℃低溫離心10 min；取上清液，用4 mol/L的KOH溶液調(diào)pH值至6.0；8000 r/min，4 ℃重復(fù)離心10 min；取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，得腦組織腺苷酸溶液。

1.6 腦線粒體膜電位測(cè)定 采用2μg/μL線粒體10μL，加入稀釋液C 400μL，加入染色劑B 15μL混勻，放置冰槽內(nèi)孵育10 min，取30μL混合液至載玻片上。在激發(fā)波長(zhǎng)590 nm、散發(fā)波長(zhǎng)610 nm波段條件下，用激光共聚焦觀察反映線粒體膜電位的紅色熒光。在激發(fā)波490 nm、散發(fā)波590 nm條件下，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定反映線粒體膜電位的相對(duì)熒光單位（RFU）。

1.7 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物I、III活性的測(cè)定將提取到的各組線粒體配制成蛋白濃度為1μg/μL的線粒體懸浮液，用分光光度法檢測(cè)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性，具體方法參照上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司提供的試劑盒說(shuō)明書操作。

1.8 腦組織ATP、ADP、AMP含量測(cè)定 儀器：日本島津C18ODS色譜分析柱(5μm，200 mm×4.6 mm)，柱溫為16 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.1 mL/min，平衡8 min。流動(dòng)相A：150 mmol/L KH2PO4+150 mmol/L KCl，用2 mol/L KOH調(diào)pH至6.0；流動(dòng)相B：85% A相+15%乙腈；實(shí)驗(yàn)當(dāng)天流動(dòng)相經(jīng)0.45μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾。吸取腦組織混合液20μL測(cè)定腦組織ATP，ADP，AMP含量，并計(jì)算總腺苷酸TAN(TAN=ATP+ADP+AMP)及細(xì)胞能荷EC[EC=(ATP+1/2 ADP)/TAN]值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大腦組織SOD、GSH活性測(cè)定 見(jiàn)表1。

2.2 腦組織線粒體電鏡觀察 A組線粒體空泡化，嵴基本消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；細(xì)胞漿內(nèi)溶酶體、尼氏體明顯增多（見(jiàn)圖1）；B組線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常(見(jiàn)圖2)。

圖1 A組大腦線粒體（×15000）

圖2 B組大腦線粒體（×15000）

圖3 A組confocal（×600）

圖4 B組confocal（×600）

2.3 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ活性 與B組比較，A組大腦線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物I、III活性均明顯降低，差異有顯著性（P<0.01），見(jiàn)表2。

表2 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物I、III活性變化（U/mg）

2.4 線粒體膜電位測(cè)定 與B組相比：A組小鼠大腦線粒體膜電位熒光染色紅光明顯減少，表明A組線粒體膜電位受到抑制（見(jiàn)圖3、圖4）；熒光分光光度計(jì)的定量測(cè)量結(jié)果提示A組線粒體膜電位值明顯降低，差異有顯著性（P<0.01），見(jiàn)表3。

表3 線粒體膜電位（RFU/μg·μL）

表4 兩組小鼠腦組織腺苷酸含量(μmol/g干腦組織)

2.5 腦組織ATP，ADP，AMP含量的測(cè)定及EC，TAN的計(jì)算 兩組小鼠腦組織腺苷酸含量及EC水平比較見(jiàn)表4、圖5和圖6。與B組相比較：A組的ATP，AMP，TAN濃度均顯著降低，差異有顯著性（P<0.01）；兩組的EC，ADP濃度差異無(wú)顯著性。

圖5 A組大腦能量水平(HPLC)

圖6 B組大腦能量水平(HPLC)

3 討論

ATP是生命活動(dòng)的源泉，細(xì)胞的代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、電活動(dòng)和肌肉收縮等生理過(guò)程都需要ATP提供能量。 ATP產(chǎn)生不足勢(shì)必影響細(xì)胞的代謝與功能，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷[6]，也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎癥等病理生理過(guò)程的主要原因之一[6-7]。線粒體是產(chǎn)生ATP主要場(chǎng)所，提供機(jī)體所需要能量的90%以上。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，暴露于慢性低氧高二氧化碳環(huán)境可影響小鼠的線粒體的功能：低氧高二氧化碳組小鼠的ATP，AMP，TAN濃度顯著降低，表明線粒體的產(chǎn)能功能受到了明顯影響。

暴露于慢性低氧高二氧化碳環(huán)境造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的線粒體產(chǎn)能功能障礙的原因很多：電鏡發(fā)現(xiàn)低氧高二氧化碳組小鼠腦線粒體空泡化，脊消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，提示慢性低氧高二氧化碳組的小鼠大腦線粒體形態(tài)破壞。其次，本實(shí)驗(yàn)也同時(shí)發(fā)現(xiàn)低氧高二氧化碳組小鼠大腦的線粒體膜電位明顯抑制，而線粒體膜的完整及其電位正常是維持線粒體生物學(xué)功能必要條件。線粒體膜電位抑制可能同氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，線粒體內(nèi)的自由基與線粒體膜進(jìn)行電子交換，導(dǎo)致膜電位改變[6-9]。第三，線粒體呼吸鏈又稱電子傳遞鏈，由四種復(fù)合物、細(xì)胞色素C和輔酶Q組成，其中線粒體COXI和III，既是電子載體，又是遞氫體，也是線粒體呼吸鏈中對(duì)自由基損害特別敏感的部位[10-11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧高二氧化碳組小鼠線粒體COXI和III活性顯著下降，可能與自由基損傷有關(guān)。由于自由基具有獲取電子從而達(dá)到穩(wěn)定的化學(xué)狀態(tài)傾向，因此它能誘發(fā)對(duì)細(xì)胞的組成成分的損傷[12-13]。線粒體既是自由基的來(lái)源，又是自由基的作用靶點(diǎn)。自由基作用于線粒體DNA、線粒體膜、電子傳遞鏈、Ca2+通道等使線粒體損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧高二氧化碳組小鼠腦組織中SOD，GSH活性顯著降低。SOD，GSH是內(nèi)源性氧自由基清除劑， 保護(hù)細(xì)胞免受氧化性損傷，其活性可反映機(jī)體清除氧自由基的能力，因此，SOD，GSH活性降低，是線粒體形態(tài)功能障礙的重要原因之一。

由此可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即暴露于慢性低氧高二氧化碳環(huán)境造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦的線粒體功能障礙，對(duì)揭示COPD所致的認(rèn)知功能障礙的病理生理機(jī)制有著重要意義。

[1]Viegi G, Scognamiglio A, Baldacci S. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)[J].Respiration, 2001,68(1):4-19.

[2]胡麗燕,王小同,寇雪蓮,等.慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶改變及咖啡因的干預(yù)作用[J].中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2007(7):68-71.

[3]陳松芳,邵勝敏,吳志鵬,等.慢性低O2高CO2對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)NMDAR1亞基表達(dá)的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2007,23(4):434-437.

[4]李勇,宮劍,邵勝敏,等.慢性低O2高CO2對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞TLR4和NFκB的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2009，25(1):27-30.

[5]李笑蓉,王小同.腺苷A2A受體與慢性低O2高CO2小鼠神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的關(guān)[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,39(2):119-122.

[6]胡碩,胡成平. 線粒體與細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].國(guó)際呼吸雜志,2006,26(6):463-470.

[7]Haeberlein SL.Mitochondrial function in apoptotic neuronal cell death[J].Neurochem Res,2004,29:521-30.

[8]劉旺華,李花,周小青,等.三七總皂苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注海馬細(xì)胞Ca~(2+)及線粒體膜電位的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(1):99-101.

[9]鐘煉敏,王文文,陶慧敏,等.共固定化腫瘤壞死因子和干擾素誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡的線粒體膜電位研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2009,26(5):972-977.

[10]劉樹森.線粒體呼吸鏈與活性氧[J].生命科學(xué),2008,20(4):519-527.

[11]孫飛,周強(qiáng)軍,孫吉,等.線粒體呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)[J].生命科學(xué),2008,20(4):566-578.

[12]李兵,柳君澤,陳麗芬,等.缺氧對(duì)大鼠心肌線粒體能量代謝和腺苷酸轉(zhuǎn)位酶活性的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2006,22(3):460-463.

[13]徐瑜,柳君澤,夏琛,等.棕櫚酸對(duì)模擬高原低氧大鼠離體腦線粒體解耦聯(lián)蛋白活性及質(zhì)子漏的影響[J].生理學(xué)報(bào),2008,25,60(1):59-64.

[14]夏琛,柳君澤,徐瑜,等.GDP在體外對(duì)大鼠腦線粒體脫耦聯(lián)蛋白活性和表達(dá)的影響[J].生理學(xué)報(bào), 2008,25,60(4):492-496.

[15]柳君澤,夏琛,徐瑜,等.線粒體能量生成各環(huán)節(jié)在模擬高原缺氧大鼠腦ATP生成障礙中的作用[J].高原醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(3):6-7.