黃曉燕，陳碧新，高瞻，張明英，王賽斌，楊德業(yè)

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，溫州醫(yī)學(xué)院 心血管生物和基因研究所，浙江 溫州 325000)

在我國高血壓病人群中，高血壓性視網(wǎng)膜病變的陽性率為70%左右，其所致眼底血管的改變基本上與高血壓3個(gè)時(shí)期的變化相一致，在一定程度上能反映體內(nèi)動(dòng)脈的情況，對(duì)判斷高血壓病的嚴(yán)重程度和預(yù)后有一定的價(jià)值[1]。有關(guān)高血壓性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制尚未明了，其微血管結(jié)構(gòu)改變大多是通過檢眼鏡或眼底熒光素血管造影觀察到的，如江時(shí)森等[2]通過墨汁灌注法觀察到自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)視網(wǎng)膜微動(dòng)脈存在微血管稀少現(xiàn)象，但在這一病理過程中，視網(wǎng)膜微血管病變是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)鮮見報(bào)道。近年來，隨著視網(wǎng)膜微血管消化鋪片技術(shù)的應(yīng)用，使直接觀察視網(wǎng)膜微血管的形態(tài)學(xué)變化成為了可能。本研究應(yīng)用視網(wǎng)膜消化鋪片，HE染色直接觀察視網(wǎng)膜微血管的形態(tài)學(xué)特征，并對(duì)微血管進(jìn)行定量分析，同時(shí)采用TUNEL法特異性標(biāo)記來觀察13周齡和18周齡SHR視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡情況，旨在探討細(xì)胞凋亡與高血壓視網(wǎng)膜微血管病變的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型和試劑 雄性SHR和正常血壓大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）各10只（其中13，18周齡各5只），由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)在溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房，飲自來水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，生活在晝夜節(jié)律為12 h、保持一定溫度和濕度的空間。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于美國Roche公司。顯色劑為DAB，購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 血壓測(cè)定及眼底拍照 用0.35%戊巴比妥麻醉大鼠后，在安靜狀態(tài)下用計(jì)算機(jī)化多導(dǎo)生理記錄儀間接測(cè)定鼠尾動(dòng)脈收縮壓，同時(shí)在裂隙燈下觀察各組大鼠眼底動(dòng)脈情況，拍照。

1.3 視網(wǎng)膜血管消化鋪片的制備 過量麻醉處死大鼠，用新鮮配制的4%多聚甲醛心臟灌流固定后摘除眼球，將眼球置于4%多聚甲醛中4 ℃ 24 h。在顯微鏡下自角膜緣后0.5 mm處剪開眼球，去除眼前節(jié)和玻璃體，剝離視網(wǎng)膜，將其放入3%胰蛋白酶溶液內(nèi)，37 ℃孵育2～3 h，消化神經(jīng)組織，然后在蒸餾水中輕輕吹打，僅留一薄層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，將其貼于潔凈的載玻片上，自然干燥，待染色。

1.4 視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變觀察 將制備好的消化鋪片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變，各組大鼠選5張切片，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400），應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，測(cè)定視網(wǎng)膜毛細(xì)血管面積密度，毛細(xì)血管面積密度（%）=毛細(xì)血管總面積/視網(wǎng)膜總面積。

1.5 TUNEL標(biāo)記法 將視網(wǎng)膜消化鋪片按照ROCHE公司提供的TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行原位缺口末端標(biāo)記檢測(cè)。樣本先用0.01 mol PBS緩沖液浸洗2次各5 min后再按照試劑盒說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照：用50μL指示液代替TUNEL反應(yīng)液；陽性對(duì)照：實(shí)驗(yàn)前用Dnase-1消化組織（室溫30 min）以打斷所有細(xì)胞DNA鏈，余步驟同前；各步驟后均用0.01 mmol PBS緩沖液浸洗樣本5 min×3次。

普通光鏡下觀察細(xì)胞凋亡，陽性染色隨凋亡程度的不同呈淺棕至深棕褐色，定位于胞核，根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)[3]確定著色陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞：①單個(gè)散在分布；②具有凋亡的核形態(tài)(核固縮或染色質(zhì)濃聚附邊或核碎裂)；③周圍無炎癥反應(yīng)。對(duì)于缺乏凋亡核形態(tài)的陽性細(xì)胞，除非染色強(qiáng)度與背景有鮮明對(duì)比，且呈單個(gè)分布，否則不認(rèn)為是凋亡細(xì)胞[4]。非凋亡細(xì)胞呈紫藍(lán)色，為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠鼠尾動(dòng)脈收縮壓變化 13周齡與18周齡SHR收縮壓分別為（148.8±9.9）mmHg、（154.4±17.9）mmHg，WKY分別為（75.9±3.2）mmHg、（75.7±5.9）mmHg，相同周齡SHR組血壓與WKY組比較差異均有顯著性 (P<0.01)，兩組組內(nèi)不同周齡比較，差異均無顯著性(P>0.05)。

2.2 眼底檢查 可見眼底動(dòng)靜脈由視乳頭分出后呈放射狀，與人眼底不同，無動(dòng)靜脈交叉，無黃斑結(jié)構(gòu)。對(duì)照組眼底未見異常（見圖1），SHR組13周齡和18周齡均可見視網(wǎng)膜動(dòng)脈變細(xì)，管徑不規(guī)則，管壁反光增強(qiáng)，靜脈迂曲擴(kuò)張，視網(wǎng)膜水腫，反光增強(qiáng)，未見到片狀出血點(diǎn)（見圖2）。根據(jù)Reith-Wagener的4級(jí)分類法，相當(dāng)于高血壓眼底第I、第II級(jí)的改變。

圖1 WKY 13周齡眼底血管片

圖2 SHR 13周齡眼底血管片

2.3 視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變 光鏡下，WKY組毛細(xì)血管網(wǎng)管徑粗細(xì)均勻一致，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞均勻分布，內(nèi)皮細(xì)胞核呈橢圓形，位于毛細(xì)血管中央或稍偏位，較周細(xì)胞略大，與血管平行；周細(xì)胞核呈短橢圓形、圓形或三角形，位于毛細(xì)血管壁的側(cè)面，稍突出于血管壁（見圖3）。SHR組血管管徑粗細(xì)不均，周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分布不均勻，部分毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)已破壞，13周齡 SHR部分毛細(xì)血管閉塞呈細(xì)線狀（見圖4），18周齡SHR除了部分毛細(xì)血管表現(xiàn)為血管管腔閉塞外，其間無內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞影，血管腔完全閉鎖，即無細(xì)胞毛細(xì)血管形成（見圖5）。13周齡與18周齡SHR毛細(xì)血管面積密度分別為（0.3720±0.0239）、（0.2840±0.0336），WKY分別為（0.5240±0.0422）、（0.4940±0.0207），SHR組毛細(xì)血管面積密度顯著低于WKY組（P<0.01），且隨著周齡增加，SHR組毛細(xì)血管面積密度逐漸減少（P<0.05）。

圖3 WKY大鼠視網(wǎng)膜鋪片毛細(xì)血管(HE，×400)

圖4 SHR 13周齡視網(wǎng)膜鋪片毛細(xì)血管(HE，×400)

圖5 SHR 18周齡組視網(wǎng)膜鋪片可見毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)已破壞，部分血管未見周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(HE，×400)

2.4 視網(wǎng)膜微血管細(xì)胞凋亡變化 SHR組大鼠視網(wǎng)膜微血管可見TUNEL陽性細(xì)胞，且18周齡陽性細(xì)胞與13周齡比較明顯增多（見圖6、8），WKY組大鼠視網(wǎng)膜微血管未見TUNEL陽性細(xì)胞（見圖7、9）。13周齡SHR組每個(gè)高倍視野凋亡細(xì)胞為（8.8±5.50）個(gè)，18周齡SHR組為（19.2±7.08）個(gè)，兩組比較，差異有顯著性（P<0.05）。

圖6 SHR 13周齡TUNEL特異性標(biāo)記（×400）

圖7 WKY 13周齡TUNEL特異性標(biāo)記（×400）

圖8 SHR 18周齡TUNEL特異性標(biāo)記（×400）

3 討論

高血壓視網(wǎng)膜病變是高血壓最重要的靶器官損害之一。眼底視網(wǎng)膜血管屬微血管范疇，是全身可以直接在體外觀察的微血管，觀察視網(wǎng)膜微血管的改變將有助于高血壓視網(wǎng)膜病變及其他高血壓靶器官損害的研究。微血管稀少是指高血壓時(shí)直徑<40μm微動(dòng)脈及毛細(xì)血管在數(shù)量上的減少[5]。Hutchins等[6]于1974年首次指出微血管稀少是高血壓的重要特征。Pewitt等[7]指出微血管稀少分兩個(gè)階段：在早期毛細(xì)血管密度降低是功能性的，是由于血管收縮所致的無灌注現(xiàn)象；后期則為器質(zhì)性微血管稀少，即毛細(xì)血管的真正關(guān)閉，表現(xiàn)為毛細(xì)血管數(shù)目在解剖上的稀少，一旦過渡為此階段即被認(rèn)為是走出了高血壓導(dǎo)致靶器官結(jié)構(gòu)性損害的第一步，而且是不可逆的。早期視網(wǎng)膜毛細(xì)血管密度的下降可直接影響交換面積，進(jìn)而影響組織、細(xì)胞的物質(zhì)交換，局部物質(zhì)代謝能力有所下降，出現(xiàn)局部組織細(xì)胞的損害，氧分壓降低、缺血和低氧而導(dǎo)致視細(xì)胞外節(jié)和節(jié)細(xì)胞等結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變，從而形成在高血壓早期即造成高血壓靶器官損害——高血壓視網(wǎng)膜病變[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用視網(wǎng)膜消化鋪片直接觀察視網(wǎng)膜微血管來反映高血壓狀態(tài)下的微血管改變，結(jié)果顯示，13周齡及18周齡SHR視網(wǎng)膜毛細(xì)血管密度較同期WKY組有明顯下降，出現(xiàn)了微血管稀少，且同時(shí)出現(xiàn)血管壁結(jié)構(gòu)的改變，表明SHR大鼠視網(wǎng)膜微血管出現(xiàn)了器質(zhì)性稀少或功能性與器質(zhì)性稀少并存的狀況。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在微血管稀少方面起一定的作用。血管細(xì)胞凋亡是高血壓發(fā)生與發(fā)展的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。1995年國外學(xué)者Hamet[10]提出，可能是細(xì)胞凋亡導(dǎo)致了微血管稀少。Gobe等[11]在建立的一腎一夾Goldblat高血壓大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌小動(dòng)脈及骨骼肌內(nèi)微血管數(shù)量的明顯減少與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)，認(rèn)為高血壓時(shí)細(xì)胞凋亡在微血管稀少中扮演了一個(gè)重要角色。本研究通過TUNEL染色鋪片觀察到，13周齡和18周齡SHR大鼠均發(fā)現(xiàn)有TUNEL染色陽性細(xì)胞，且18周齡SHR組TUNEL陽性細(xì)胞與13周齡組比較明顯增多。Kobayashi等[12-13]提出氧化應(yīng)激促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和微血管稀疏，并認(rèn)為通過應(yīng)用可透過細(xì)胞的過氧化物清除劑進(jìn)行抗氧化處理可抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及防止自發(fā)性高血壓大鼠的微血管稀疏。可以誘導(dǎo)微血管細(xì)胞凋亡的因素很多，但引起凋亡的機(jī)制尚不清楚，尚待進(jìn)一步研究。

上述結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡可能是促進(jìn)高血壓靶器官損害---高血壓視網(wǎng)膜病變病程發(fā)展、病情惡化的重要原因之一，在微血管稀少中扮演著重要的角色，是促進(jìn)高血壓的發(fā)生和發(fā)展的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。設(shè)法干預(yù)凋亡從而減少組織細(xì)胞損害是一項(xiàng)重要課題。阻止早期微血管細(xì)胞的凋亡，改善微血管稀少，可能為治療高血壓視網(wǎng)膜病變及防治高血壓靶器官損害開辟一條新的途徑。

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