陳 曼,祝 絢,譚積善,胡啟飛,吳民瀘,段佳慧,代 娟,賴 翼

(1.成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系,四川成都610083;2.成都市第九人民醫(yī)院,四川成都610015;3.成都軍區(qū)總醫(yī)院,四川成都610083;4.成都第一制藥廠,四川 成都610504)

肺結(jié)核病是嚴重威脅人類健康的重大傳染性疾病之一,“是單病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病”[1],但只要能早期診斷合理用藥,絕大多數(shù)的結(jié)核病人可以治愈。因此提高診斷陽性率和診斷速度對于防治結(jié)核病具有重要意義[2]?，F(xiàn)有的結(jié)核病實驗室診斷方法陽性率普遍較低[3]。熒光定量PCR(FQ-PCR)能夠快速檢出結(jié)核桿菌,但是在不同的樣品中陽性率差異較大,特別是對于有污染的樣品,常常發(fā)現(xiàn)有抑制現(xiàn)象[4]。本文通過自制的鹽酸胍消化液對樣品進行處理,希望提高在不同樣品中的結(jié)核桿菌的檢出率,以期對肺結(jié)核病人的早期診斷及治療。

1 材料和方法

1.1標本來源收集成都醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院、成都軍區(qū)總醫(yī)院和成都第九人民醫(yī)院臨床疑是肺結(jié)核病患者標本185份,男 124例,女61例,年齡在20-75歲之間。標本類型有痰液、血液、尿液、膿液、胸腹水、肺泡灌洗液和心包積液等。

1.2主要儀器中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)的DA7600型實時熒光定量PCR儀。

1.3主要試劑

1.3.1鹽酸胍消化液 自制(5 mol/L鹽酸胍,50 mmol/L Tris-CI pH7.5,25 mmol/L EDTA和0.1 mol/Lβ-巰基乙醇)。

1.3.2結(jié)核分支桿菌(TB)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒,結(jié)核分支桿菌陽性定量參考欠,購于中山大學(xué)達安基因股份有限公司;L-J培養(yǎng)基購于成都飛奧生物技術(shù)有限公司。

1.4方法

1.4.1將各種類型的標本分成相同的2份,為對照組,按照醫(yī)院的常規(guī)方法涂片鏡檢和培養(yǎng),并按照試劑盒書說明提取DNA,另一份對不同標本處理如下:血液加入等體積的鹽酸胍消化液混合,對部分有凝塊樣品,37°孵育20 min。加入10 ml無菌水混合 ,室溫 10 min,5 000-6 000 g,離心15 min,保留沉淀物。

痰加2倍體積的鹽酸胍消化液,漩渦30 s,加入10 ml無菌水混合,室溫10 min,對有血污染、高膿性和粘液性的痰標本,室溫多放置10 min,5 000-6 000 g,離心15min,保留沉淀物。

其他EDTA抗凝管收集胸腹水,防止凝塊形成,5 000-6 000 g,離心10min,然后沉淀物按照痰標本方式加工;乳狀標本,25 000 g離心后,用一個無菌棉試子除去脂肪,沉淀物用2倍體積的鹽酸胍消化液清洗2次,然后用無菌水洗;很粘稠的標本,加入2倍體積的鹽酸胍消化液,漩渦混合,37°孵育15-30 min,加入10 ml無菌水,離心;腦脊液標本,25 000 g離心,先用鹽酸胍消化液清洗,然后水洗。所有標本離心后保留沉淀物。

1.4.2顯微鏡檢和培養(yǎng) 沉淀用500 μ l無菌水再懸浮,取 50 μ l用于直接涂片鏡檢 ,另取 225 μ l接種在L-J培養(yǎng)基上。

1.4.3DNA 提取 225 μ l加入1.5 ml管中離心,20 000 g,5 min,加入50 μ l DNA 提取液(試劑盒自帶),100℃恒溫處理10 min后離心取上清2 μ l至PCR反應(yīng)管內(nèi)。

1.4.4FQ-PCR檢測 將制備好的所有DNA模板與陰陽性對照及陽性標準品一同擴增,按照試劑盒要求93℃2 min,93℃45 s,55℃60 s反應(yīng)10個循環(huán),93℃30 s,55℃45 s,30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后存盤分析結(jié)果,陽性判斷的標準為增長曲線呈典型S型,最強熒光值較基礎(chǔ)熒光值增高20單位以上。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用 χ2檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)結(jié)果的比較經(jīng)鹽酸胍消化液處理后的樣品沒有喪失結(jié)核桿菌的繁殖能力,兩種方法陽性結(jié)果的一致率為100%。對照組培養(yǎng)的標本在16天內(nèi)菌落成陽性,而用鹽酸胍消化液處理的細菌有2-3天的延后,同時細菌數(shù)略低于對照組,但是兩者沒有可評估的差異。

2.2涂片鏡檢對照組涂片抗酸染色鏡檢發(fā)現(xiàn)陽性數(shù)12例,陽性率6.49%,經(jīng)鹽酸胍消化液處理后的標本,涂片發(fā)現(xiàn)陽性數(shù)25例,陽性率13.51%,兩者比較 χ2=5.075,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,特別是對于有血污染的,膿性的,粘液性的標本,直接涂片的標本較厚,且背景污染嚴重。經(jīng)鹽酸胍消化液處理后,沒有改變細菌的染色性質(zhì)及完整性。

2.3不同檢樣中FQ-PCR的陽性率比較用鹽酸胍緩沖液處理后的樣品FQ-PCR陽性檢出數(shù)普遍高于試劑盒的方法,同時與培養(yǎng)結(jié)果的一致性也高于試劑盒的方法。經(jīng)兩種方法處理后,總陽性數(shù)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01。其中,血液、尿液、胸腹水、腦脊液標本比較,χ2值分別為9.88、6.09、5.28、6.49,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意思,而其他類型標本沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上有意義的差異。血液標本的差異最大,結(jié)果見表1。

表1 不同檢樣中兩種處理方法的FQ-PCR陽性率比較

3 討論

對結(jié)核病人的實驗室診斷,常規(guī)的鏡檢法、培養(yǎng)法及PCR法,受標本中細菌數(shù)及抑制物質(zhì)的干擾,敏感度不高一直困繞臨床醫(yī)生和檢驗人員[5]。除了方法本身的因素外,標本的留取和前處理將直接影響檢測的靈敏度和結(jié)果的準確性。在臨床工作中,標本常直接或濃縮集菌后用于鏡檢和培養(yǎng)。而定量PCR,對標本的處理是試劑盒常用的NaOH法,但堿消化法影響菌體活性而不適用于培養(yǎng)[6]。

對結(jié)核的檢測,常會根據(jù)病變部位收集相應(yīng)的標本,各類標本間的細菌量和內(nèi)容物都相差很大。目前的標本處理的方法經(jīng)研究對痰液和肺泡灌洗液的加工較好[7],常規(guī)方法敏感性較高,但對血液、腦脊液等的敏感性較低[8],因此急需一種適用于各類標本的能用于常規(guī)結(jié)核菌檢出的標本加工方法。

本文采用自制的鹽酸胍消化液對各類標本進行處理,鹽酸胍消化液是一種中性促溶劑,因此不需要再對它進行中和。實驗證明,經(jīng)鹽酸胍消化液處理后的標本能夠增加每張玻片鏡檢時的細菌量,在不改變細菌的染色性和完整性的同時有效去除細胞碎片和背景污染,從而提高涂片染色鏡檢的敏感性。經(jīng)L-J培養(yǎng)后,顯示了較強的生長能力,與對照組標本相比,沒有顯示出可評估的差異。

FQ-PCR應(yīng)用于臨床以來,多數(shù)試劑盒受標本中抑制物的影響。用鹽酸胍消化液處理后的各類樣品FQ-PCR的陽性率普遍提高于,同時與培養(yǎng)結(jié)果的一致性也高于單純用試劑盒的方法。對血液、尿液、胸腹水、腦脊液等常規(guī)方法撿出率較低的標本顯示出了更高的陽性率,而其他類型標本沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上有意義的差異。

以上研究結(jié)果表明鹽酸胍消化液能從多種臨床物質(zhì)中分離出無抑制的高質(zhì)量的分支桿菌DNA,是一種快速、簡單的和廉價的方法,適用于多種類型的實驗室標本。

[1]張永樂,朱明利,張利誠,等.增菌熒光定量PCR檢測痰及血液中結(jié)核桿菌的臨床應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(9):1834.

[2]Piersimoni C,Scarparo C.Relevance of commercial amplification methods for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical sample[J].J Clin Microbiol,2003,41(12):5355.

[3]姚 剛,張淑娟.幾種結(jié)核桿菌檢測方法的臨床應(yīng)用評價[J].中國實驗診斷學(xué),2007,11(12):1699.

[4]D.Lemus,E.Montoro,M.Echemendia,et al.Nitrate reductase assay for detection of drug resistance inMycobacterium tuberculosis:simple and inexpensive method for low-resource laboratories[J].J Med Microbiol,2006,55(7):2471.

[5]Farnia,P,F.Mohammadi,Z.Zarifi,et al.Improving sensitivity of direct microscopy for detection of acid-fast bacilli in sputum:use of chitin inmucus digestion[J].J Clin Microbiol,2002,40(2):508.

[6]A.Martin,F.Portaels,and J.C.Palomino,et al.Colorimetric redox-indicator methods for the rapid detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis:a systematic review and meta-analysis[J].J Antimicrob Chemother,2007,59(2):175.

[7]Takahashi,T.,Nakayama,T.Novel Technique of Quantitative Nested Real-Time PCR Assay for Mycobacterium tuberculosis DNA[J].J Clin Microbiol,2006,44(3):1029.

[8]Wade K.Aldous,June I.Pounder,Joann L.Cloud,et al.Comparison of Six Methods of Extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from Processed Sputum for Testing by Quantitative Real-Time PCR[J].American Society forMicrobiology,2005,43(5):2471.