彭清潔,石 磊,毛存志,張雅莉,白智迪,胡長敏,鄧立新,陳煥春,郭愛珍＊

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢430070;3.湖北省武漢科前生物制品有限公司,湖北 武漢430070;4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南鄭州 450002)

肉牛“易地育肥”即傳統(tǒng)的肉牛產(chǎn)區(qū)飼養(yǎng)繁殖母牛并向其它地區(qū)銷售架子牛供育肥用已成為我國肉牛生產(chǎn)的一種主要模式。我國南方有大量的荒山草坡及農(nóng)作物秸桿,具有豐富的飼料資源,但由于南方本地缺少優(yōu)質(zhì)肉牛品種及飼養(yǎng)繁殖母牛利潤低,育肥用的架子牛主要購自“中原肉牛帶”、“北方肉牛帶”與其它牧區(qū)。因此,“北牛南運(yùn)”已成為“易地育肥”的重要組成部分。

然而,“北牛南運(yùn)”后發(fā)生的疾病問題嚴(yán)重困擾著南方肉牛業(yè)的發(fā)展。肉牛引入后半月左右開始發(fā)生一種傳染病,發(fā)病率可達(dá)80%,死亡率可高達(dá)40%以上。2008年首次鑒定這種病為牛支原體肺炎綜合征[1,2],該病是發(fā)生于新引入肉牛、由牛支原體(mycoplasma bovis,M.bovis)引起的、以壞死性支氣管肺炎為主要特征、繼發(fā)或并發(fā)關(guān)節(jié)炎、腹瀉、結(jié)膜炎等多種癥狀的一種傳染性疾病。該病在國外育肥場普遍發(fā)生,稱為慢性肺炎 多發(fā)性關(guān)節(jié)炎綜合征(chronic pneumonia and polyarthritis syndrome,CPPS)[3,4]或牛支原體相關(guān)肺炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎(mycoplasma bovis-associated pneumonia and polyarthritis)等[5,6]。

由于牛支原體肺炎綜合征主要發(fā)生于新引入肉牛,推測長途運(yùn)輸導(dǎo)致的運(yùn)輸應(yīng)激是該病發(fā)生的重要誘因。為了證實(shí)該推測,本研究對兩批長途運(yùn)輸牛進(jìn)行了不同的處理,第一批牛進(jìn)行了牛支原體滅活疫苗免疫,第二批牛進(jìn)行了鹽酸氯丙嗪注射,全程跟蹤運(yùn)輸過程,并在運(yùn)達(dá)后繼續(xù)臨床跟蹤1月以上。結(jié)果證實(shí),啟運(yùn)前注射鹽酸氯丙嗪可以降低牛引入后的發(fā)病率。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸氯丙嗪注射液(chlorpromazine hydrochloride injection)購自武漢,由天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn);牛支原體滅活疫苗由本實(shí)驗(yàn)室制備,用實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的牛支原體進(jìn)行液體培養(yǎng),菌濃度108個/mL,0.5%甲醛滅活,加白油乳化而成。

1.2 試驗(yàn)方法

進(jìn)行兩批牛試驗(yàn),第一批牛試驗(yàn)?zāi)康闹荚谟^察啟運(yùn)前免疫在減少或阻止新引入肉牛發(fā)病中的作用,第二批牛旨在觀察肌肉注射鹽酸氯丙嗪在減少或阻止新引入肉牛發(fā)病中的作用。牛來自北方交易市場,購牛前對牛進(jìn)行仔細(xì)觀察與臨床檢查,挑選健康牛。侯選牛暫養(yǎng)在某臨床觀察點(diǎn)上,臨床檢查健康及連續(xù)3d觀察無臨床異常后決定購買。在此基礎(chǔ)上選擇試驗(yàn)牛,對牛群分組進(jìn)行試驗(yàn)。所有牛只運(yùn)輸途中不提供水和任何食物。

表1 第一批試驗(yàn)牛分組及處理情況表

1.2.1 牛支原體滅活疫苗免疫后運(yùn)輸試驗(yàn) 第一批試驗(yàn)牛39頭購自吉林省長春市某交易市場,品種為西門塔爾與本地牛的雜交,牛體重200 kg左右。分成兩組(表1):即免疫組和對照組,其中免疫組23頭,對照組16頭。免疫組牛支原體滅活疫苗免疫劑量為2 mL/頭,起運(yùn)前7 d肌肉注射疫苗。免疫牛與對照牛隨機(jī)裝車。運(yùn)輸時間為36 h,運(yùn)至河南省鄢陵縣。

1.2.2 啟運(yùn)前鹽酸氯丙嗪肌注后運(yùn)輸試驗(yàn) 第二批試驗(yàn)牛購自黑龍江省哈爾濱市某交易市場。品種為西門塔爾與本地牛的雜交。體重在250～400 kg,共60頭。按體重范圍分成三群,分別為250～300 kg、300～ 350 kg、350～400 kg,每群各 20頭。各群均分為對照組與試驗(yàn)組,各10頭。對照牛不做任何處理,試驗(yàn)牛啟運(yùn)前肌肉注射亞治療劑量的氯丙嗪,按注射劑量分為A處理和B處理。A處理為肌肉注射氯丙嗪0.3 mg/kg,B處理為肌肉注射氯丙嗪0.6 mg/kg。具體分組及處理細(xì)節(jié)見表2。免疫牛與對照牛隨機(jī)裝車。運(yùn)輸時間為48小時,運(yùn)至江西省新余縣。

1.2.3 血清牛支原體抗體檢測 以牛支原體重組蛋白GAPDH作為包被抗原的間接ELISA檢測免疫牛的血清牛支原體抗體。按常規(guī)ELISA程序進(jìn)行[7],簡述如下:牛支原體重組GAPDH蛋白提純至電泳純,按100 ng/孔包被,待檢血清200倍稀釋,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛二抗做5000倍稀釋,DAB/H2O2顯色,HF終止反應(yīng),以O(shè)D450值表示抗體水平。

表2 第二批試驗(yàn)牛分組及處理情況表

1.2.4 牛群運(yùn)抵牛場后的臨床檢查 牛運(yùn)達(dá)目的場后,按逐漸增加粗、精飼料的方法飼喂。每日定時檢測體溫,觀察臨床變化,觀察期為35 d,并作詳細(xì)記錄。

2 試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 試驗(yàn)牛發(fā)病的整體情況

試驗(yàn)牛運(yùn)達(dá)牛場后,進(jìn)行了35 d的觀察,發(fā)病癥狀基本類似。比較二批牛對照組46頭牛的發(fā)病率,整體發(fā)病率為67%(31/46),其中第一批與第二批的發(fā)病率分別為75%(12/16)和63%(19/30)。發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為體溫升高(39.5～41.5℃)、咳嗽、流鼻汁,繼發(fā)拉稀,少數(shù)出現(xiàn)流淚、有眼分泌物和跛行(表3)。由于對發(fā)病牛進(jìn)行了及時治療,二批牛均未出現(xiàn)死亡。

表3 免疫組與對照組肉牛引入后的發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)

牛運(yùn)達(dá)牛場的發(fā)病時間存在批次差異,對照組第一批牛開始發(fā)病時間在到場后10～19 d間,第二批牛開始發(fā)病時間較早,在到場后6～14 d間發(fā)病(圖1)。啟運(yùn)前對牛進(jìn)行疫苗接種或肌肉注射鹽酸氯丙嗪都使開始發(fā)病時間提前,第一批牛疫苗接種組的開始發(fā)病時間為到場后第6～15 d,開始發(fā)病時間較對照組提早了4 d;第二批牛肌肉注射鹽酸氯丙嗪組的開始發(fā)病時間為到場后第3～7 d,開始發(fā)病時間較對照組提早了3 d(圖1)。

2.2 牛支原體滅活疫苗免疫對肉牛引入后發(fā)病的影響

圖1 不同處理組牛到牛場發(fā)病時間比較

比較免疫組與非免疫組,免疫組牛的發(fā)病情況較非免疫組嚴(yán)重,部分牛的發(fā)病時間提早至第6 d,發(fā)病牛比例增加,免疫組發(fā)病率為83%(19/23),而非免疫組發(fā)病率75%(12/16),說明啟運(yùn)前免疫不利于預(yù)防肉牛引入后發(fā)病,免疫應(yīng)激對發(fā)病有促進(jìn)作用。

用GAPDH間接ELISA檢測免疫牛的血清牛支原體抗體水平,用OD450值表示,免疫前抗體水平為0.799±0.208,免疫后的抗體水平為 1.000±0.116,免疫前后抗體水平存在顯著差異(P=0.002)(圖 2)。

圖2 免疫牛接種前及接種后15 d的牛支原體抗體水平(以O(shè)D450值表示)

2.3 鹽酸氯丙嗪啟運(yùn)前注射對肉牛引入后發(fā)病的影響

鹽酸氯丙嗪肌肉注射組(試驗(yàn)組)與對照組比,試驗(yàn)組的發(fā)病率為30%(9/30),而對照組的發(fā)病率高一倍,為63%(19/30),說明鹽酸氯丙嗪亞治療劑量肌肉注射對降低發(fā)病率有顯著效果。比較鹽酸氯丙嗪不同劑量組的發(fā)病率,A組按0.3 mg/kg用藥, 而B 組按0.6 mg/kg 用藥, 結(jié)果B 組的發(fā)病率為20%(3/15),而 A組的發(fā)病率為B組的 2倍,即40%(6/15);A組和B組發(fā)病率差異極顯著(P<0.01),說明鹽酸氯丙嗪降低發(fā)病率的效果具有劑量依賴性,高劑量效果更顯著。比較不同體重組的發(fā)病率,對照組小體重組(250～300 kg)牛的發(fā)病率為90%(9/10),較其它兩個高體重組高1.8倍,300～350 kg組和350～400 kg體重組的發(fā)病率均為50 %;統(tǒng)計(jì)分析顯示, 小體重組(250 ～ 300 kg)牛的發(fā)病率較大體重組(300～350 kg)及(350～400 kg)牛發(fā)病率差異顯著(P<0.05),說明小體重牛抵抗力較高體重組差(表4)。

表4 啟運(yùn)前肌注鹽酸氯丙嗪后肉牛發(fā)病率比較

3 討論

由于肉新引入后發(fā)病與長途運(yùn)輸環(huán)節(jié)密切相關(guān),而運(yùn)輸應(yīng)激錯綜復(fù)雜,包括饑、渴、運(yùn)動、疲勞、冷、熱、擁擠、噪聲等多種應(yīng)激原,能顯著降低機(jī)體免疫力,健康威脅很大[9]。國內(nèi)外的相關(guān)研究證實(shí),這種發(fā)生于新引入肉牛、以呼吸道癥狀為主的綜合征是由牛支原體引起的傳染病[1～8]。在本研究中,我們通過啟運(yùn)前進(jìn)行牛支原體滅活疫苗接種或注射鹽酸鹽酸氯丙嗪作為抗應(yīng)激措施評價這兩種處理方法對肉牛引入后發(fā)病的影響。

二批牛的對照牛發(fā)病率分別為75%和63%,平均67%,發(fā)病癥狀與流行病學(xué)與先前報道的牛支原體肺炎綜合征一致,因此推測該研究中的發(fā)病情況是牛支原體肺炎綜合征。由于這兩批牛有專職技術(shù)員全程跟蹤與及時治療,未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。不同批次牛群發(fā)病率的差異可能與牛的個體體質(zhì)差異、牛的來源和年齡、牛經(jīng)牛販子倒賣的環(huán)節(jié)多少與時間長短等因素有關(guān)。

接種組發(fā)病較對照組嚴(yán)重也說明了啟運(yùn)前接種導(dǎo)致的免疫應(yīng)激能加重肉牛引入后發(fā)病。即使是檢測發(fā)現(xiàn)血清抗體顯著增加,但循環(huán)抗體未能阻止發(fā)病。即便是肌肉注射抗應(yīng)激劑,對牛體也是一種新的應(yīng)激原,注射組開始發(fā)病時間提前也支持該觀點(diǎn)。因此,合理的免疫程序應(yīng)是在養(yǎng)殖場做好疫苗注射,并證實(shí)體內(nèi)誘導(dǎo)了確實(shí)的免疫反應(yīng)后再考慮運(yùn)輸。

在目前沒有疫苗與治療效果不佳的情況下,我們再嘗試通過減少應(yīng)激除低肉牛引入后發(fā)病。鹽酸氯丙嗪具有鎮(zhèn)定作用,使用適當(dāng)劑量能降低牛對應(yīng)激原的敏感性,從而減少疾病的發(fā)生,因此被用作抗應(yīng)激劑[10]。本研究證實(shí),肌肉注射氯丙嗪能顯著減少肉牛引入后疾病的發(fā)生率。獸藥手冊[11]推薦的牛治療劑量是0.5～1.0 mg/kg.次,本研究使用了0.6 mg/kg和0.3 mg/kg兩種亞治療劑量,事先評價了該劑量對肉牛無不良影響,然后將該劑量用于試驗(yàn)牛,結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.6 mg/kg比0.3 mg/kg效果更好,說明肉牛引入后發(fā)病確實(shí)與運(yùn)輸應(yīng)激有關(guān),盡量減少應(yīng)激能有效降低發(fā)病率。

綜上所述,認(rèn)真挑選健康牛、啟運(yùn)前給予抗應(yīng)激劑(肌注鹽酸氯丙嗪)、運(yùn)達(dá)目的場后加強(qiáng)護(hù)理(早期發(fā)現(xiàn)與治療發(fā)病牛)能有效降低新引入肉牛的發(fā)病率與死亡率。

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