唐霍全,仝海波,光俊榮,范益民,劉躍亭,郝解賀

腦血管痙攣(CVS)是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)常見的并發(fā)癥之一,發(fā)病率高達(dá)30%～90%,是導(dǎo)致患者傷殘率和病死率居高不下的主要原因之一[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn),痙攣血管壁組織的凋亡在血管痙攣形成的機(jī)制中有重要的作用[2,3],阿托伐他汀具有保護(hù)神經(jīng)和改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠SAH后早期應(yīng)用阿托伐他汀對基底動(dòng)脈的影響,探討其對SAH后CVS的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠30只,體重250 g～300 g,購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、SAH 組(B組)、阿托代他汀組(C組)。

1.2 藥品與試劑 阿托伐他汀(遼寧輝瑞制藥有限公司,每片20 mg),T UNEL試劑盒(北京中杉金橋公司),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3 動(dòng)物模型制作與標(biāo)本處理[5]動(dòng)物模型制作:采用枕大池二次注血法制作大鼠SAH-CVS動(dòng)物模型。10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后,大鼠頭部及左側(cè)股動(dòng)脈區(qū)備皮,常規(guī)消毒;大鼠仰臥位,暴露左側(cè)股動(dòng)脈備用;然后改俯臥位,取枕外隆凸以下約2.0 cm正中直切口,暴露枕骨、環(huán)椎及環(huán)枕膜,用1 mL注射器針頭刺破環(huán)枕膜并稍稍推進(jìn)到達(dá)枕大池;有腦脊液流出后,用1 mL注射器抽取股動(dòng)脈血0.3 mL,在2 min之內(nèi)注入枕大池;注血后環(huán)枕膜穿刺處填塞明膠海綿一塊,俯臥位頭低30°約30 min,以利血液沉積在腦底血管周圍,縫合頭部及股部切口。48 h后同法抽取右側(cè)股動(dòng)脈血0.3 mL注入枕大池,制成大鼠SAH動(dòng)物模型。假手術(shù)組僅在枕大池內(nèi)注射生理鹽水(0.3 mL),其余步驟相同。

灌胃:首次注射后1 h開始灌胃,每日1次,連續(xù)給7 d。阿托伐他汀組:給予阿托伐他汀20 mg/(kg?d)灌胃[4](溶于2 mL蒸餾水)1次給予。假手術(shù)組與SAH組灌喂同阿托伐他汀組相同體積的蒸餾水2 mL,1次給予。標(biāo)本處理:所有大鼠均于第一次手術(shù)后7 d處死。處死前均給予10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥位固定,開胸,用 12號針頭左心室穿刺快速灌入37℃生理鹽水300 mL,待心臟鼓起后在右心房迅速剪開一小口,放出血液,生理鹽水在5min內(nèi)灌完,再灌入4℃4%的多聚甲醛至少30 min等組織變硬后取出帶完整基底動(dòng)脈的腦干,然后置于上述灌注液中繼續(xù)固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,切片(4 μ m)。

1.4 管壁厚度和內(nèi)徑周長的測量 腦干橫斷面石蠟切片行蘇木精-伊紅(HE)染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠BA微觀結(jié)構(gòu)的變化,用Image Pro Plus v5.0圖像分析軟件測量BA血管內(nèi)徑周長和血管壁厚度。

1.5 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測 石蠟組織切片常規(guī)脫蠟至水,依次滴加蛋白酶K,TUNEL反應(yīng)混合液,T UNEL過氧化物酶標(biāo)抗體(POD),DAB溶液顯色至水,蘇木精復(fù)染,脫水,透明,中性樹膠封片。同時(shí)做不加TdT酶,其他條件相同的陰性對照。每張切片于250倍光學(xué)顯微鏡下觀察3個(gè)無重復(fù)視野,每只動(dòng)物觀察3張切片。計(jì)算呈棕色的Tunel陽性細(xì)胞核和所有細(xì)胞核,細(xì)胞凋亡率=(陽性細(xì)胞核數(shù)/所有細(xì)胞核數(shù))×100%[6]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下觀察BA微觀結(jié)構(gòu)的變化 假手術(shù)組BA血管內(nèi)皮細(xì)胞完整平覆于內(nèi)彈力纖維環(huán)上,平滑肌細(xì)胞排列有序呈長梭形環(huán)繞血管腔,平滑肌層薄。SAH組可見內(nèi)皮細(xì)胞隨內(nèi)彈力纖維向血管腔隆起,平滑肌細(xì)胞排列雜亂,平滑肌層較厚。阿托代他汀組則介于二者之間。

2.2 顯微鏡觀察并計(jì)算BA內(nèi)徑周長和管壁厚度(見表1)SAH組與阿托伐他汀組的內(nèi)徑周長較假手術(shù)組均減少(P＜0.01),管壁厚度卻較假手術(shù)組均增加(P＜0.05或P＜0.01);而SAH組內(nèi)徑周長減少和管壁厚度增加較阿托伐他汀組更顯著(P＜0.05)。

表1 SD大鼠BA血管壁內(nèi)徑周長、厚度及細(xì)胞凋亡率(±s)

表1 SD大鼠BA血管壁內(nèi)徑周長、厚度及細(xì)胞凋亡率(±s)

組別 n 內(nèi)徑周長 管壁厚度(μ m)細(xì)胞凋亡率(%)假手術(shù)組 10 885.71±21.68 11.21±0.98 12.64±1.91 SAH 組 10 594.94±18.382) 16.91±0.562) 6.55±1.212)阿托伐他汀組 10 721.95±24.192)3) 12.09±0.591)3) 3.44±0.742)3)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與SAH組比較,3)P＜0.05

2.3 T UNEL法檢測細(xì)胞凋亡率(見表1)假手術(shù)組BA平滑肌細(xì)胞凋亡率較低,SAH組與阿托伐他汀組平滑肌細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組均增多(P＜0.01),而阿托伐他汀組細(xì)胞凋亡率較SAH組更顯著(P＜0.01)。

3 討 論

SAH后CVS的高發(fā)生率是多因素共同作用的結(jié)果,具體機(jī)制尚不完全清楚。陳斌等[7]研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀具有誘導(dǎo)血管壁平滑肌細(xì)胞凋亡的作用,并認(rèn)為平滑肌細(xì)胞的凋亡不足是內(nèi)膜損傷后導(dǎo)致管腔狹窄的重要因素。SAH發(fā)生后,特別是自發(fā)性動(dòng)脈瘤性SAH必然有血管壁的損傷,引起血管壁平滑肌細(xì)胞的增殖,一旦血管壁平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡不能達(dá)到平衡,勢必會(huì)造成血管腔的狹窄,從而引發(fā)一系列的癥狀。阿托伐他汀可以調(diào)節(jié)二者的動(dòng)態(tài)平衡,從而達(dá)到對受累血管的解痙作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TUNEL法檢測BA平滑肌細(xì)胞的凋亡指數(shù),發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀組明顯高于SAH組,證明阿托伐他汀可以促進(jìn)血管壁平滑肌細(xì)胞的凋亡。通過測量BA血管壁厚度與內(nèi)徑周長的變化也可以發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀組較SAH組有所改善,說明阿托伐他汀對緩解SAH后CVS有一定的作用。Cheng等[4]研究也證實(shí)阿托伐他汀具有改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的作用。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,受內(nèi)在遺傳機(jī)制控制自動(dòng)結(jié)束生命的過程。細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用的 因素主 要有Caspase家族 、Bcl-2家族 、Fas、p53、C-myc、C-fos、C-jun以及線粒體。血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定對血管平滑肌功能起著重要的調(diào)節(jié)作用,并且參與了平滑肌細(xì)胞的凋亡過程。尼莫地平通過對Ca2+的調(diào)控來影響細(xì)胞內(nèi)Caspase-3與Bcl-2表達(dá),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[8]。阿托伐他汀能夠增高血管平滑肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-M g2+-ATP酶活性[9],使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加,引起細(xì)胞內(nèi)Caspase-3與Bcl-2表達(dá)的變化,進(jìn)而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡。SAH后CVS是一個(gè)復(fù)雜的過程,是多種因素共同作用的結(jié)果,所以阿托伐他汀通過調(diào)節(jié)血管壁平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化來誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的凋亡對緩解CVS具有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示假手術(shù)組與阿托伐他汀組血管壁厚度和內(nèi)徑周長差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。說明阿托伐他汀對緩解SAH后CVS雖有一定的作用,但并不能完全解除受累血管的痙攣狀態(tài),因此在臨床中應(yīng)該與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用。

此外,SAH后CVS的發(fā)生與血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)皮衍生舒張因子和內(nèi)皮衍生收縮因子的動(dòng)態(tài)平衡有密切關(guān)系,NO是一種作用極強(qiáng)的血管舒張因子,可以對抗內(nèi)皮素(ET)的縮血管作用,從而緩解CVS。據(jù)研究顯示阿托伐他汀有增加一氧化氮的生物活性,對緩解SAH后CVS起到一定的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)沒有對阿托伐他汀的這一作用進(jìn)行驗(yàn)證,可能與其對BA平滑肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)共同起作用來綬解SAH后引發(fā)的CVS。

總之,阿托伐他汀通過上述途徑來調(diào)節(jié)SAH后CVS,阿托伐他汀調(diào)節(jié)CVS的作用可能還有其他途徑,尚需進(jìn)一步研究。

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