潘妍婷,崔萬森

神經(jīng)細胞凋亡是造成腦梗死后神經(jīng)功能缺損的重要機制之一[1],腦缺血半暗帶的細胞損傷主要通過細胞凋亡途徑進行,而神經(jīng)細胞凋亡是一種受基因控制的自主性、程序性死亡過程。

期間細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax,以及死亡結構域蛋白FADD蛋白在細胞凋亡中起著重要作用,通過本組實驗,動態(tài)觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡及凋亡相關蛋白的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 成年健康雄性SD大鼠20只,體重250 g～280 g,清潔級,由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。應用線栓法經(jīng)右側頸總動脈插線建立右側大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,隨機分為兩組。模型組(n=16):即缺血 2 h 再灌注 6 h、12 h、24 h、72 h;假手術組(n=4):除不插線外,其余步驟同模型組。

1.2 標本的采集 模型組動物在規(guī)定的時間里取材。分別于缺血2 h再灌注6 h、12 h、24 h、72 h取材,假手術組于手術后1 d取材:大鼠在10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉下,經(jīng)左心室插管至升主動脈,依次灌入生理鹽水200 mL、4%的多聚甲醛300 mL,灌注完畢后,斷頭取腦,自額極至枕葉分為5等分,取中間份石蠟包埋。制備厚3 μ m的連續(xù)切片。

1.3 免疫組化染色方法 對各個組不同時間點腦組織中細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax以及FADD蛋白進行染色。FADD采用SABC法,抗體效價1∶100,生物素化羊抗兔IgG系武漢博士德生物公司產品,染色步驟按照免疫組化試劑盒說明進行。Bcl-2、Bax蛋白檢測Ⅰ抗(兔抗大鼠Bcl-2、BaxIgG),Ⅱ抗(生物素標記山羊抗兔IgG)染色步驟按照免疫組化試劑盒說明進行。Bcl-2、Bax FADD均以胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽性。

1.4 TUNEL細胞凋亡檢測 對各組不同時間點腦組織切片染色,嚴格按TUNEL試劑盒(武漢博士德生物公司)說明書進行操作。光鏡下陽性細胞核呈棕黃色。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用圖像統(tǒng)計處理系統(tǒng),選擇不同時間點標本切片,分別在皮質區(qū),在高倍鏡下(400×)隨機選擇5個不重復觀察視野,進入圖像處理系統(tǒng),各時間點陽性細胞計數(shù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較用t檢驗。

2 結 果

2.1 凋亡相關蛋白表達 假手術組:Bcl-2、Bax表達以及FADD蛋白表達很弱。模型組:不同再灌注時間點缺血半暗帶區(qū)Bcl-2表達不同,缺血側皮質區(qū)再灌注6h缺血半暗帶區(qū)Bcl-2表達明顯增多,再灌注24 h后,Bcl-2表達既已減弱;缺血側皮質區(qū)缺血2 h再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)Bax既有表達,隨著再灌注時間的延長,陽性細胞數(shù)逐漸增加,24 h達高峰,鏡下見陽性細胞著色加深。FADD蛋白表達:缺血側皮質區(qū)缺血2 h再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)既有表達增強,72 h達高峰,不同再灌注時間點凋亡相關蛋白表達情況詳見表1。

2.2 TUNEL表達 陽性細胞主要位于缺血周圍區(qū),缺血中心區(qū)未見陽性細胞表達。假手術組:有弱表達,胞核染色陽性,細胞體積較小且收縮變形。模型組:缺血2 h再灌注6 h,缺血半暗帶區(qū)TUNEL陽性細胞有表達,隨時間的延長逐漸增多,再灌注24 h表達達高峰,不同再灌注時間點缺血半暗帶區(qū)TUNEL陽性細胞計數(shù)不同。詳見表1。

表1 不同再灌注時間點缺血半暗帶區(qū)細胞凋亡、FADD、Bcl-2和Bax陽性細胞數(shù)(±s)

表1 不同再灌注時間點缺血半暗帶區(qū)細胞凋亡、FADD、Bcl-2和Bax陽性細胞數(shù)(±s)

組別 凋亡細胞 FADD蛋白表達 Bcl-2 Bax假手術組 10.15±2.25 50.23±5.18 13.20±2.23 11.56±2.28模型組 6 h 35.23±3.34 103.26±5.34 19.87±2.34 35.23±3.34 12 h 48.46±2.25 105.43±6.36 27.45±3.321) 48.46±2.25 24 h 57.62±2.791) 123.45±3.58 22.46±2.49 55.63±2.711)72 h 52.32±3.87 136.34±4.621) 17.22±2.13 49.23±2.72與假手術組比較,1)P＜0.01

3 討 論

3.1 大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的變化 缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程,最終引發(fā)缺血級聯(lián)反應,最終導致神經(jīng)元死亡。而細胞死亡有兩種形式,即細胞壞死和細胞凋亡。本組實驗中缺血再灌注后,大鼠缺血側皮層出現(xiàn)大量的TUNEL陽性細胞,再灌注24 h達高峰,并在缺血半暗帶區(qū)細胞出現(xiàn)凋亡細胞。這與相關報道:大鼠MVAO模型缺血2 h再灌注 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、細胞凋亡的觀察,表達規(guī)律相符合[2]。

3.2 大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關蛋白 Bcl-2、Bax和FADD表達對凋亡細胞的影響 細胞凋亡的發(fā)生取決于促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白濃度。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中兩類典型的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白,發(fā)生凋亡時,Bcl-2家族蛋白通過成員間的異二聚化、磷酸化、蛋白水解等方式,最終定位于線粒體膜引起膜通透性的改變[3],并和Bax通過形成異源二聚體時,實現(xiàn)了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能[4]。

本試驗中,假手術組皮層 Bcl-2和Bax只有少量表達,而缺血再灌注損傷后大鼠缺血側皮層Bcl-2和Bax表達明顯增多,Bcl-2的這種神經(jīng)保護作用主要依賴于對凋亡的抑制。本實驗中Bcl-2蛋白在缺血早期表達明顯上調,至再灌注6 h達高峰,以后逐漸下降,表明缺血再灌注最初階段,Bcl-2蛋白發(fā)揮著細胞保護作用,但隨著時間的延續(xù),凋亡級聯(lián)反應出現(xiàn),細胞受損加重,Bcl-2蛋白降解增加,表達逐漸下降;促凋亡蛋白Bax表達在缺血早期表達逐漸上調,24 h達高峰,當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡,其時間與空間的分布與T UNEL陽性神經(jīng)元一致,與本實驗結果一致,提示Bax在介導缺血性神經(jīng)元損傷中起重要作用。

FADD是一種死亡結構域胞漿蛋白,國內外對FADD與腦梗死關系研究報道極少,FADD是死亡受體Fas介導的凋亡通路中重要的促凋亡因子[5],能與胞質區(qū)Fas特異性結合,其在Fas等多條外源性凋亡信號途徑中起著重要作用[6],FADD與Fas二者的死亡域相互作用,激活半胱氨酸蛋白酶級聯(lián),導致細胞死亡。Xiao等[7]研究發(fā)現(xiàn),缺血再灌注后3 h缺血半暗帶內FADD蛋白表達顯著上調,12 h達高峰,并且其表達水平與腦梗死最終神經(jīng)細胞凋亡數(shù)呈正相關。本組實驗顯示,缺血再灌注皮質區(qū),隨再灌注時間的延長,FADD蛋白表達在再灌注6 h即顯著上調,12 h達高峰,與細胞凋亡表達規(guī)律一致,提示FADD蛋白參與細胞凋亡過程。而這種間接促凋亡作用機制有待于進一步探討。

[1]Xu XH,Zhang SM,Yan WM,et al.Development of cerebral infarction,apoptotic cell death and expression of X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein following focal cerebcal ischemia in rats[J].Life Sci,2006,78:704-710.

[2]Li J,Marion G,Yuzhi Yin,et al.Subcellular distribution and redistribution of Bcl-2 family proteins in human leukemia cells undergoing apoptosis[J].Blood,1999,93(16):2354-2357.

[3]Roset R,O rtet L,Gomez G.Role of Bcl-2 family members on apoptosis:What we have learned from knock-out mice[J].Front Biosci,2007,12(20):4722-4728.

[4]Lalier L,Cartron PF,Juin P,et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis,2007,12(5):887-895.

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[6]Thorburn A.Death receptor-induced cell killing[J].Cell Signal,2004,16:139-143.

[7]Xiao B,Bi FF,Hu YQ,et al.Edaravone neuroprotection effected by suppressing the gene expression of the Fas signal pathway following transient focal ischemia in rats[J].Neurotox Res,2007,12:155-161.