梁智星,楊志剛,郭建軍,張 勇,王志斌,李志英

近20年來,心 肺 聯(lián) 合 移 植(combined heart-lung transplantation,CHLT)已被證實(shí)是治療終末期心肺衰竭的一種有效治療方法。供體在獲取、保存和移植過程中發(fā)生的心肺缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是導(dǎo)致移植后早期肺功能障礙甚至移植失敗的主要原因,如何做好供體心肺的獲取和保存,減輕IRI,是當(dāng)前肺移植和心肺聯(lián)合移植研究的熱點(diǎn)之一。本文就L-Arg在防治心肺缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步的研究,期望為L-Arg的臨床新用途提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年犬 20只,體重(16.2±1.5)kg,雌雄不拘,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 體外循環(huán)機(jī):STOKERT-SHILEY循環(huán)機(jī),呼吸機(jī):Newport Wave E200 ventilator,血?dú)夥治鰞x:美國I-STAT,電鏡:JEM-100CX電鏡,恒溫干燥箱:上海躍進(jìn)儀器廠,L-Arg:上海生物化學(xué)工程技術(shù)研究所,NO、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒:南京建成生物工程研究所,LPD液、St.thomas液:山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心臟外科。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組各10只,每次實(shí)驗(yàn)使用供體犬和受體犬各1只。每組受體犬體重大于供體犬體重的18%～20%[1]。心肺灌注與保存分別使用4℃的LPD液和St.thomas液。對(duì)照組僅用4℃的St.thomas液及LPD液灌注心肺并保存,實(shí)驗(yàn)組于St.thomas液及LPD液中分別加入 L-Arg 500 mg/kg及300 mg/500 mL,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前需要禁食12 h。

1.3.2 異體原位CHLT模型的建立 供體犬:肌注氯胺酮(20 mg/kg)和安定(0.5 mg/kg)麻醉后,固定于手術(shù)臺(tái)上,氣管插管,呼吸機(jī)機(jī)控制呼吸,全身肝素(3 mg/kg)化。正中開胸,打開心包,縫主動(dòng)脈與肺動(dòng)脈荷包線,置入灌注導(dǎo)管并固定,阻斷升主動(dòng)脈,經(jīng)主動(dòng)脈根部灌注4℃St.thomas液或?qū)嶒?yàn)組含加入 L-Arg的 St.thomas液(20 mL/kg,壓力 100 mmHg),同時(shí)經(jīng)主肺動(dòng)脈灌注4℃LPD液或?qū)嶒?yàn)組含加入 L-Arg的 LPD液(60 mL/kg～80 mL/kg,壓力 15 cmH2O～20 cmH2O,5 min內(nèi)灌注完),灌注的同時(shí)切開左心耳使灌注液流出,直至灌洗液無色透明,肺呈現(xiàn)白色。中度膨肺(70%～80%),鉗夾氣管,切斷升主動(dòng)脈、上下腔靜脈、氣管、食管和肺韌帶,整塊切除心肺并修剪。供心肺放入 4℃的 LPD液保存 1.5 h～2 h。

受體犬:麻醉同前,經(jīng)上下腔靜脈及升主動(dòng)脈建立體外循環(huán)(CPB),切除心肺,移植入供心、肺。開始吻合前,供心灌注4∶1冷血(10℃)高鉀停搏液(20 mL/kg),(實(shí)驗(yàn)組加入 L-Arg 24 mmol/L),分別行氣管、主動(dòng)脈、右心房吻合,氣管吻合完畢后,灌注4:1冷血(10℃)低鉀停搏液一次(20 mL/kg),(實(shí)驗(yàn)組加入L-Arg 24 mmol/L),開始主動(dòng)脈吻合時(shí),復(fù)溫。復(fù)溫完畢后行右心房吻合,右心房后壁吻合結(jié)束,開放循環(huán)。繼續(xù)并行CPB復(fù)溫,同時(shí)吻合右心房前壁,心臟復(fù)跳有力,待循環(huán)穩(wěn)定,鼻咽溫升至 36℃～37℃,停 CPB。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 在CHLT過程中,分別測(cè)受體麻醉后、主動(dòng)脈開放5 min和30 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的靜脈血?dú)夥治?。取心肺勻漿組織 4℃離心(3 000 r/min)10 min后,取上清液,應(yīng)用 NO檢測(cè)試劑盒,采用硝酸還原酶法,檢測(cè)心肺勻漿組織中的NO的含量,應(yīng)用MDA檢測(cè)試劑盒,采用硫代巴比妥酸法,測(cè)定心肺勻漿組織中MDA的含量,按照 SOD檢測(cè)試劑盒說明,采用黃嘌呤氧化酶法,測(cè)定心肺勻漿組織中SOD的活性。

1.5 肺含水量測(cè)定 肺組織用生理鹽水沖洗后,立即稱濕重量,然后在70℃的干燥箱下烘 72 h,稱其干重量,計(jì)算肺組織的濕/干重比(W/D)。

1.6 肺組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 切取供肺上葉組織(1 mm×1 mm×1 mm)用2.5%戊二醛固定,4℃保存,通過JEM-100CX透射電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)間PaO2、PaCO2檢測(cè)結(jié)果(見表 1)

表1 兩組不同時(shí)間PaO2、PaCO2檢測(cè)結(jié)果(±s)mmHg

表1 兩組不同時(shí)間PaO2、PaCO2檢測(cè)結(jié)果(±s)mmHg

組別 PaO2受體麻醉后 主動(dòng)脈開放5 min 主動(dòng)脈開放 30 min實(shí)驗(yàn)組 510.5±18.401) 330.7±48.702) 121.5±9.611)對(duì)照組 478.7±21.73 229.1±40.12 106.9±8.83組別 PaCO2受體麻醉后 主動(dòng)脈開放5 min 主動(dòng)脈開放 30 min實(shí)驗(yàn)組 23.10±7.12 23.74±4.511) 32.17±5.822)對(duì)照組 26.85±7.40 31.52±4.60 45.65±5.70與對(duì)照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 移植心肌組織、肺組織 NO、SOD、MDA的含量(見表2、表3)

表2 兩組移植肺組織NO、SOD、M DA的含量比較(±s)

表2 兩組移植肺組織NO、SOD、M DA的含量比較(±s)

組別 NO μ mol/L SOD U/(mg?port)MDA nmol/(mg?port)實(shí)驗(yàn)組 7.92±2.07 55.52±7.98 4.31±0.65對(duì)照組 2.46±1.27 35.05±6.31 5.43±0.71 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.05

表3 兩組移植心肌組織NO、SOD、M DA的含量比較(±s)

表3 兩組移植心肌組織NO、SOD、M DA的含量比較(±s)

組別 NO μ mol/L SOD U/(mg?port)MDA nmol/(mg?port)實(shí)驗(yàn)組 5.62±1.37 78.65±5.63 6.56±0.87對(duì)照組 1.24±0.32 21.38±3.98 7.84±1.13 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.05

2.3 肺組織的濕/干重比 實(shí)驗(yàn)組為(5.32±0.14),對(duì)照組為(6.07±0.32),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 肺組織電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組肺泡Ⅱ型細(xì)胞胞漿大小不等、空泡化,板層小體結(jié)構(gòu)融合、線粒體嵴不清晰、血管內(nèi)皮細(xì)胞壁不完整,肺泡上皮細(xì)胞少見。而實(shí)驗(yàn)組肺泡Ⅱ型細(xì)胞的板層小體結(jié)構(gòu)清晰,線粒體嵴可見,較多完整血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞。

3 討 論

隨著各種治療手段的進(jìn)展,心肺聯(lián)合移植已成為一種治療晚期心肺疾病的有效方法。盡管已有許多改進(jìn)措施,心肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷仍是導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因之一,也是移植后發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的重要危險(xiǎn)因素[2]。因此,如何改進(jìn)心肺保存方法,提高心肺保存質(zhì)量,延長保存時(shí)間,減輕心肺缺血再灌注損傷成為心肺聯(lián)合移植基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。

L-Arg是NO的生理性前體,其生物學(xué)活性大部分是經(jīng)過一氧化氮合成酶(NOS)作用生成 NO而起作用的[3,4]。NO具有進(jìn)入血管平滑肌激活鳥苷酸環(huán)化酶,使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低,血管平滑肌松弛,抑制纖維蛋白原與血小板結(jié)合,減少毛細(xì)血管通透性、保持血管內(nèi)皮的完整性等作用。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞是體內(nèi)合成NO的最主要細(xì)胞,移植肺在缺血再灌注這一病理生理過程中受到損傷,病理狀態(tài)下肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞NOS減少,其產(chǎn)物NO也隨之減少[5]。肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致的通透性增高是缺血再灌注損傷后的基本病理改變,這種損傷主要表現(xiàn)為肺毛細(xì)血管通透性增加,進(jìn)而導(dǎo)致肺水腫,影響肺組織中的氣體交換。肺組織的濕/干重比在一定程度上可以反映肺功能受損的嚴(yán)重程度[6]。肺氣體交換功能障礙被認(rèn)為是評(píng)價(jià)肺缺血再灌注損傷程度及其保護(hù)效果最敏感的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組測(cè)定移植心肺NO的含量比對(duì)照組高,W/D較對(duì)照組減輕,實(shí)驗(yàn)組PaO2比對(duì)照組高,而PaCO2比對(duì)照組低。其病理學(xué)研究亦發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組肺泡出血及間質(zhì)水腫較對(duì)照組減輕,表明L-Arg在肺灌注保存液中能減輕肺毛細(xì)血管的內(nèi)皮損傷,減少 CPB中的體液積聚,可減輕移植肺間質(zhì)水腫[7],減輕肺缺血再灌注損傷。

目前研究表明氧自由基生成過多或清除障礙時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。它可引起細(xì)胞內(nèi)毒性反應(yīng),如細(xì)胞器破壞、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)酶失活,核酸破壞等導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,其活性的高低反映了機(jī)體清除氧自由基的能力,而MDA作為判定氧自由基造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷的指標(biāo)之一,反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的破壞程度[9]。L-Arg可通過促進(jìn)NO的產(chǎn)生,減少過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)生成,同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化物谷胱苷肽的水平,還可直接中和氧自由基,消除氧自由基對(duì)心肌及肺組織的損害。本研究實(shí)驗(yàn)組心肺組織SOD含量明顯高于對(duì)照組,MDA含量較對(duì)照組顯著降低,提示 L-Arg可抑制缺血再灌注自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化,增強(qiáng)內(nèi)源性清除氧自由基的能力,從而減輕心肺缺血再灌注損傷。

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