梁 慧,陳還珍,劉錦秀,郎曉青

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見微血管并發(fā)癥,是導(dǎo)致糖尿病(DM)患者死亡的重要原因。有研究證實,血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,抑制AngⅡ產(chǎn)生并干擾其作用過程是糖尿病腎病治療的關(guān)鍵[1]。實驗性糖尿病動物組織中可以發(fā)現(xiàn)AngⅡ增多[2]。AngⅡ與高血糖是血管功能障礙(內(nèi)皮和平滑肌功能障礙)并發(fā)癥發(fā)生的起始和持續(xù)危害因素,可以造成血管收縮的高反應(yīng)性、胰島素抵抗及增加氧化應(yīng)激損傷。氯沙坦是一種血管緊張素Ⅱ1型(AT1)受體拮抗劑,能與AT1R特異結(jié)合,阻斷 AngⅡ的作用。過去有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠用氯沙坦治療后,可以防止糖尿病所引起的心臟電生理及代謝方面的改變[3]?，F(xiàn)已證實內(nèi)皮衍生舒張因子的化學(xué)本質(zhì)就是一氧化氮,血管內(nèi)皮功能障礙特征的表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞源性一氧化氮生成減少或活性減低,其生物學(xué)效應(yīng)表現(xiàn)為血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的減弱或消失[4]。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(A RB)已被證實具有保護腎臟、改善血管內(nèi)皮功能的作用,在臨床上也得到應(yīng)用。本實驗進一步探討氯沙坦對糖尿病腎病大鼠主動脈內(nèi)皮舒張功能影響及NO含量的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠 30只,體重(150±20)g,購養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,批號:山醫(yī)字第070101號。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 30只Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、氯沙坦鉀組,每組各10只。

1.4.2 動物模型制作 30只大鼠適應(yīng)環(huán)境生長1周,除了正常組大鼠外,其余兩組用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,切除右側(cè)腎臟。切除腎臟2周后,模型組和氯沙坦鉀組一次性腹腔注射STZ(50 mg/kg STZ溶于檸檬酸鹽緩沖液,pH值為4.5),而正常組腹腔注射等體積的檸檬酸鹽緩沖液(不含STZ,pH為4.5)。注射STZ大鼠,3 d后測大鼠尾靜脈血糖,若血糖高于16.7 mmol/L,定為糖尿病模型建立。2周后測定大鼠血糖、24 h尿蛋白。若血糖＞16.7 mmol/L、24 h尿蛋白＞30 mg/(kg?d)認為DN模型成立[5]。

1.4.3 給藥方法 糖尿病腎病大鼠模型制作成功后,氯沙坦鉀組每日固定時間給予氯沙坦鉀灌胃(20 mg/kg),氯沙坦鉀用量的調(diào)整依據(jù)體質(zhì)量的變化,維持在每日20 mg/kg,正常組和模型組每日給予等量的生理鹽水,實驗周期共12周。

1.5 檢測方法

1.5.1 血糖、24 h尿蛋白定量及體質(zhì)量測定 STZ注射3 d起,于第12周末測定正常組、模型組和氯沙坦鉀組血糖、24 h尿蛋白定量及體質(zhì)量。血糖用血糖儀測定大鼠尾靜脈方法,采用全自動多功能生化分析儀測定24 h尿蛋白定量。

1.5.2 血管環(huán)張力的測定 于大鼠麻醉后開胸,取胸主動脈,清除周圍結(jié)締組織,制成3 mm～4 mm長的血管環(huán)。將血管環(huán)置于37℃血管緩沖液的恒溫離體器官灌流浴槽中,并持續(xù)充入體積分數(shù)為95%的氧氣和5%二氧化碳混合氣體,使溶液的pH值保持在7.35～7.45,溫度保持在(37.0±0.5)℃,預(yù)張力設(shè)為1 g,平衡1.5 h,期間不斷調(diào)整張力使之保持在1 g,每20 min換液1次。

1.5.2.1 血管環(huán)對去甲腎上腺素(NE)收縮反應(yīng)性測定 待正常組、模型組與氯沙坦鉀組血管環(huán)平衡后,向浴槽內(nèi)加入不同累計濃度的 NE(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L),待張力曲線平穩(wěn)后,測定不同血管環(huán)對不同累積濃度NE反應(yīng)性。以各濃度引起的收縮幅度占最大收縮幅度的百分比表示血管條片對去甲腎上腺素的反應(yīng),并計算引起最大收縮效應(yīng)一半的藥物濃度(EC50)和最大收縮效應(yīng)(Emax)。

醫(yī)院需要充分利用外部快速發(fā)展的電子商務(wù)平臺實現(xiàn)業(yè)務(wù)發(fā)生的源頭控制。由于業(yè)務(wù)真實性核查成本高、難度大，傳統(tǒng)的會計控制限制在對票據(jù)真實性的審核上。電子商務(wù)平臺和物流業(yè)的發(fā)展為業(yè)務(wù)源頭控制提供了可能。醫(yī)院可建立服務(wù)和物資采購平臺，與天貓、京東、蘇寧易購、1號店、攜程網(wǎng)、政府采購機票管理網(wǎng)站等大型電子商務(wù)平臺對接，使醫(yī)院的采購業(yè)務(wù)通過這些高度市場化、可核查的平臺進行，自動選擇性價比高的供應(yīng)商發(fā)出采購需求，避免政府采購速度慢、價格高的缺點，同時還可按需采購，減少物資的庫存，降低醫(yī)院的管理成本。

1.5.2.2 血管環(huán)對乙酰膽堿(ACH)舒張反應(yīng)性測定 用血管緩沖液反復(fù)洗脫3次,每20min換液1次,待血管環(huán)張力回到1 g,平衡后,每組血管環(huán)用10-6mol/L NE預(yù)收縮,達最大收縮狀態(tài)時,再加入不同累積濃度 ACH(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L),記錄最大張力值,以血管環(huán)對累積濃度乙酰膽堿舒張反應(yīng)的幅度占血管環(huán)對去氧腎上腺素引起的收縮幅度之比,表示血管環(huán)對乙酰膽堿的舒張反應(yīng),計算引起最大舒張效應(yīng)一半的藥物濃度(IC50)和Emax。

1.5.2.3 血管環(huán)對硝普鈉舒張反應(yīng)性測定 同上述洗脫過程,待血管環(huán)平衡后,每組血管環(huán)用10-6mol/LNE預(yù)收縮,達最大收縮狀態(tài)時,再累積加入不同濃度硝普鈉(10-9mol/L、10-8mol/L 、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L),記錄最大張力值,用同樣于乙酰膽堿舒張反應(yīng)測定的方法,測定血管環(huán)對硝普鈉的反應(yīng)性。

1.5.3 NO含量測定 于第12周末分別取正常組、模型組及氯沙坦鉀組大鼠空腹靜脈血2 mL,離心、分離血漿,用NO試劑盒,采用硝酸還原酶法測定其含量。

2 結(jié) 果

2.1 對大鼠血糖、24 h尿蛋白、體質(zhì)量的影響 模型組及氯沙坦鉀組的血糖、體質(zhì)量明顯高于正常組(P＜0.05),模型組與氯沙坦鉀組血糖、體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。模型組、氯沙坦鉀組24 h尿蛋白定量高于正常組(P＜0.05),氯沙坦鉀組24 h尿蛋白定量明顯低于模型組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 3組血糖、尿蛋白定量和體質(zhì)量比較(±s)

表1 3組血糖、尿蛋白定量和體質(zhì)量比較(±s)

組別 n 血糖mmol/L 24 h尿蛋白定量mg/24 h體質(zhì)量g正常組 10 4.46±0.12 14.79±0.23 302.06±0.64模型組 10 21.01±0.211) 94.17±0.621) 321.71±0.321)氯沙坦鉀組 10 21.09±0.171) 58.00±0.411)2) 320.29±0.491)與正常組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05

2.2 血管環(huán)對NE收縮反應(yīng)性的影響(見表2)正常組、模型組及氯沙坦鉀組離體血管環(huán)對NE的收縮反應(yīng)性隨NE濃度的增加增強。在同一NE濃度下模型組、氯沙坦鉀組與正常組收縮反應(yīng)相似,且差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。正常組、模型組及氯沙坦鉀組 EC50、Emax差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 3組主動脈血管環(huán)對NE收縮反應(yīng)E50及Emax(±s)

表2 3組主動脈血管環(huán)對NE收縮反應(yīng)E50及Emax(±s)

組別 n EC50(×10-7mol/L)Emax(%)正常組 10 2.47±0.01 75.02±0.07模型組 10 2.50±0.02 75.10±0.11氯沙坦鉀組 10 2.48±0.01 75.02±0.07

2.3 血管環(huán)對乙酰膽堿舒張反應(yīng)性影響 模型組、氯沙坦鉀組較正常組對Ach的舒張反應(yīng)性明顯降低(P＜0.01)。氯沙坦鉀組對Ach舒張反應(yīng)性明顯高于模型組(P＜0.01)。模型組與氯沙坦鉀組與正常組IC50及Emax相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),氯沙坦鉀組與模型組IC50及Emax比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表 3。

表3 3組大鼠血管環(huán)對乙酰膽堿舒張反應(yīng)IC50及Emax(±s)

表3 3組大鼠血管環(huán)對乙酰膽堿舒張反應(yīng)IC50及Emax(±s)

組別 n IC50(×10-7mol/L)Emax(%)正常組 10 1.80±0.03 64.19±0.06模型組 10 2.57±0.021) 35.97±0.051)氯沙坦鉀組 10 2.04±0.041)2) 57.85±0.181)2)與正常組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.01

2.4 血管環(huán)對硝普鈉舒張反應(yīng)性影響(見表4)模型組、氯沙坦鉀組與正常組相比對硝普鈉的舒張反應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),正常組、模型組及氯沙坦鉀組的IC50及Emax相似,且無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 3組大鼠血管環(huán)對硝普鈉舒張反應(yīng)IC50及Emax(±s)

表4 3組大鼠血管環(huán)對硝普鈉舒張反應(yīng)IC50及Emax(±s)

組別 n IC50(×10-8mol/L)Emax(%)正常組 10 7.65±0.68 95.17±0.04模型組 10 4.52±0.50 95.45±0.03氯沙坦鉀組 10 7.07±0.55 95.26±0.05

2.5 血清NO含量測定 模型組、氯沙坦鉀組血清NO含量較正常組明顯降低(P＜0.01),氯沙坦鉀組較模型組NO含量明顯升高(P＜0.01)。詳見表5。

表5 3組血清NO含量(±s)

表5 3組血清NO含量(±s)

組別 n NO 含量(μ mo/L)正常組 10 60.97±0.53模型組 10 30.13±0.441)氯沙坦鉀組 10 44.99±0.341)2)與正常組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.01

3 討 論

由于DN的發(fā)病率逐年增加,因此對于DN的發(fā)病機制及治療手段的研究成為目前研究的熱點之一。DN是糖尿病最常見的微血管病變,最終導(dǎo)致毛細血管腔閉塞,腎小球硬化,是引起終末期腎衰竭的常見原因,糖尿病患者存在血管內(nèi)皮功能損害,是發(fā)生慢性血管并發(fā)癥的重要機制之一[6]。目前認為,內(nèi)皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化的早期改變,在糖尿病合并血管病變的發(fā)生中起重要作用[7]。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一個效應(yīng)物,是血管重塑因素中的重要介質(zhì)[8]。也是一種強血管收縮物質(zhì),可以引起腎小球內(nèi)囊壓力的升高,導(dǎo)致腎小球高灌注、高濾過,誘導(dǎo)腎小球細胞凋亡、基質(zhì)增生,導(dǎo)致腎小球萎縮、硬化,腎臟損害的早期則表現(xiàn)為微量白蛋白尿。由于循環(huán)及組織中AngⅡ的增加,刺激血管收縮,啟動血管氧化應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡和平滑肌細胞增生,導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。有研究證實,AngⅡ除了可以有收縮血管作用,還可以引起一系列的促炎癥反應(yīng),促纖維化和對代謝的影響包括氧化應(yīng)激、胰島素抵抗和細胞外基質(zhì)蛋白沉積。

近年的動物實驗中離體血管環(huán)舒縮反應(yīng)的測定,已經(jīng)成為評價血管內(nèi)皮功能的常用指標(biāo)。血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的測定可作為反映血管內(nèi)皮功能的重要指標(biāo),血管內(nèi)皮依賴性舒張功能是指內(nèi)皮細胞在藥物(Ach)等作用下釋放內(nèi)皮源性舒張因子(NO等),從而導(dǎo)致內(nèi)皮舒張,此作用依賴于內(nèi)皮的完整性。DN由于長期糖、脂代謝紊亂,造成血管內(nèi)皮細胞受損,功能紊亂[9],DN時血管舒張功能失調(diào)與血管內(nèi)皮受損相關(guān),血管內(nèi)皮功能異常的特點是內(nèi)皮依賴的舒張反應(yīng)減弱,NO合酶表達減少,抑制NO活性,氯沙坦鉀可能通過增加NO含量,從而改善血管內(nèi)皮功能。本實驗結(jié)果顯示氯沙坦鉀組大鼠NO含量明顯高于模型組且低于正常組,說明氯沙坦鉀可以增加DN大鼠NO含量,從而改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。

氯沙坦鉀片屬于ARB類藥物,國內(nèi)外多個臨床試驗已證實ARB類藥物對腎臟及血管內(nèi)皮功能的保護作用[10,11],由于循環(huán)及組織中AngⅡ的增加,刺激血管收縮,啟動血管局部氧化應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡和平滑肌細胞增生,導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。氯沙坦主要通過特異性的阻斷 AngⅡ與其受體AT1的結(jié)合產(chǎn)生腎臟和血管內(nèi)皮保護作用[12-14]。本實驗中發(fā)現(xiàn)模型組較正常組出現(xiàn)多飲、多尿、多食的糖尿病表現(xiàn),到后期出現(xiàn)尿蛋白增多等DN表現(xiàn),用氯沙坦鉀干預(yù)后發(fā)現(xiàn)氯沙坦鉀組大鼠24 h尿蛋白定量與模型組大鼠相比較明顯降低,說明氯沙坦鉀具有減少白蛋白排泄的作用,對DN有腎臟保護作用。實驗中發(fā)現(xiàn)氯沙坦鉀組大鼠血糖較模型組有所下降,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明氯沙坦鉀藥物干預(yù)后并不會明顯改善DN的血糖水平。通過離體血管環(huán)反應(yīng)性測定,氯沙坦鉀組、模型組大鼠對NE的收縮反應(yīng)和正常組相似,氯沙坦鉀組大鼠對Ach舒張反應(yīng)性明顯高于模型組,但兩組均低于正常組,而氯沙坦鉀組對硝普鈉的舒張反應(yīng)性與模型組和正常組相似。這說明DN影響血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng),而對血管內(nèi)皮非依賴性舒張反應(yīng)沒有影響,ARB可能選擇性的改善DN大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能降低的作用。

總之,通過本實驗的研究,氯沙坦鉀可以減少尿白蛋白的排泄,保護腎功能,對DN血管內(nèi)皮具有保護作用,因此早期應(yīng)用氯沙坦鉀即能顯著改善DN患者的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能及增加NO的含量,為治療DN提供參考。

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