王 微,宋二飛,戚曉靜,張軒萍,張明升

地西泮(diazepam,DZP)是苯二氮艸卓類代表性藥物,臨床上已被普遍應(yīng)用于鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗驚厥、抗癲癇,其在產(chǎn)科中的應(yīng)用也已相當(dāng)廣泛。近年發(fā)現(xiàn),DZP還能有效拮抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)因缺血缺氧和創(chuàng)傷造成的損害。DZP能引起血管平滑肌的松弛[1],較大劑量時可降低血壓,減慢心率。5-羥色胺(5-HT)作用于血管平滑肌,主要經(jīng)由5-HT2A受體介導(dǎo)而引起多數(shù)動靜脈收縮。5-HT除了能直接調(diào)節(jié)血管張力,還能增高血管平滑肌對去甲腎上腺素(NE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、組胺等縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性。當(dāng)原有動脈粥樣硬化病變或高血壓、糖尿病使血管內(nèi)皮損傷時,血小板易黏附在血管壁上,促使5-HT釋放增加,加強(qiáng)其縮血管作用,惡化疾病[2]。5-HT受體拮抗劑可治療相應(yīng)疾病,當(dāng)DZP發(fā)揮其普遍治療作用時,是否會對5-HT引起的血管改變產(chǎn)生相應(yīng)的影響,對這些疾病的治療有一定的幫助作用?本研究擬通過成年大鼠離體胸主動脈環(huán)實(shí)驗(yàn),觀察不同濃度的DZP對5-HT誘導(dǎo)的血管收縮產(chǎn)生的效應(yīng),并探討產(chǎn)生這些效應(yīng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 地西泮由上海旭東制藥有限公司提供(批號071201)。5-HT、乙酰膽堿(Ach)、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAM E)、四乙胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)均購自 Sigma公司,氯化鋇(BaCl2)由上海中邦化工廠生產(chǎn),其余試劑為市售分析純。

1.2 大鼠離體主動脈環(huán)標(biāo)本的制備 SD大鼠,雄性,體重220 g～250 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將大鼠直接斷頭處死,迅速打開胸腔,分離胸主動脈,將取下的胸主動脈放入4℃的PSS液中,仔細(xì)剔除血管周圍的脂肪及結(jié)締組織,將動脈剪成3 mm～4 mm的血管環(huán)。血管環(huán)用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔,橫向懸掛在10 mL浴槽內(nèi)(浴槽內(nèi)含有通以100%氧,pH 值為7.4、37℃的PSS液10 mL),下方固定,上方以一細(xì)鋼絲連于張力換能器,使用Powerlab生物信號采集與分析系統(tǒng)記錄血管環(huán)的張力變化。每個血管環(huán)懸掛在浴槽后,調(diào)前負(fù)荷至2 g,平衡 1 h,其間調(diào)整靜息張力,使之維持在 2 g的恒定水平,每15 min換一次營養(yǎng)液。所有血管環(huán)用60 mmol/L KCl液刺激3次,待收縮穩(wěn)定后,開始正式實(shí)驗(yàn),去內(nèi)皮的實(shí)驗(yàn),用與血管內(nèi)徑相適的棉棒從管腔擦過,連續(xù)兩次,用60 mmol/L KCl液刺激,待收縮穩(wěn)定后加 10-5mol/L的Ach檢驗(yàn)血管內(nèi)皮完整性。當(dāng)Ach不產(chǎn)生舒張作用或舒張幅度小于預(yù)收縮的10%時,認(rèn)為內(nèi)皮已去除。設(shè)定60 mmol/L KCl液引起的最大收縮幅度為100%,以加入不同濃度藥物引起的血管收縮幅度與KCl誘導(dǎo)的最大收縮幅度的比率反映血管張力變化。

1.3 大鼠胸主動脈環(huán)收縮作用測定 采用內(nèi)皮完整的胸主動脈環(huán),加入KCl(60 mmol/L)待血管環(huán)收縮達(dá)到穩(wěn)定后用PSS液洗脫,使其恢復(fù)到穩(wěn)定靜息張力,在靜息張力下累積加入5-HT使浴槽中的終濃度依次遞增為10-7mol/L,3×10-7mol/L,10-6mol/L,3×10-6mol/L,10-5mol/L,3×10-5mol/L,觀察血管環(huán)的張力變化,制作5-HT的累積濃度-血管反應(yīng)曲線。

1.4 溶劑組和DZP組對大鼠胸主動脈環(huán)收縮作用的影響 采用內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的胸主動脈環(huán),加入KCl(60 mmol/L)待血管環(huán)收縮達(dá)到穩(wěn)定后用PSS液洗脫,使其恢復(fù)到穩(wěn)定靜息張力,在靜息張力下,溶劑組預(yù)孵10-4mol/L溶劑,DZP低濃度組預(yù)孵3×10-6mol/L的 DZP,高濃度組預(yù)孵 10-4mol/L的DZP,均預(yù)孵20 min,再分別加入累積濃度的5-HT,觀察血管環(huán)的張力變化。

1.5 DZP減弱5-HT誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮作用的機(jī)制研究 根據(jù)濃度-血管反應(yīng)曲線,計(jì)算靜息張力組、溶劑組、DZP低濃度組和高濃度組5-HT對血管收縮作用達(dá)50%時所對應(yīng)的濃度(即EC50值),其接近 3×10-6mol/L。在內(nèi)皮完整的胸主動脈環(huán)上,用KCl(60 mmol/L)誘發(fā)血管環(huán)收縮達(dá)穩(wěn)定后用 PSS液洗脫,恢復(fù)至穩(wěn)定靜息張力后,對照組預(yù)孵低濃度DZP后加入3×10-6mol/L的5-HT,觀察血管環(huán)的張力變化。實(shí)驗(yàn)組預(yù)孵低濃度DZP后,再分別預(yù)孵L-NAME(10-4mol/L),TEA(10-2mol/L),4-AP(10-3mol/L),BaCl2(10-3mol/L),達(dá)到穩(wěn)定收縮坪值后,加入3×10-6mol/L的 5-HT,觀察血管環(huán)的張力變化。同法,預(yù)孵高濃度DZP,觀察血管環(huán)的張力變化。

2 結(jié) 果

2.1 DZP對大鼠胸主動脈環(huán)張力的影響 在靜息張力狀態(tài)下,5-HT對大鼠離體胸主動脈環(huán)產(chǎn)生濃度依賴性的收縮作用。與靜息張力狀態(tài)下相比,溶劑組 5-HT各濃度收縮作用無明顯差異;DZP低濃度組、高濃度組收縮百分率明顯降低,5-HT濃度為3×10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L,3×10-5mol/L時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),濃度為10-7mol/L,3×10-6mol/L時無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖 1。

圖1 DZP對5-HT誘導(dǎo)的濃度依賴性血管環(huán)收縮減弱作用

2.2 內(nèi)皮對DZP減弱5-HT誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮作用的影響在去內(nèi)皮的胸主動脈環(huán)上,預(yù)孵低濃度DZP,再加入濃度遞增的5-HT,血管環(huán)呈濃度依賴性收縮,與內(nèi)皮完整組相比,其收縮百分率升高,即內(nèi)皮減弱了DZP對5-HT誘導(dǎo)的血管收縮的減弱作用。在濃度為 3×10-7mol/L,10-6mol/L,3×10-6mol/L,10-5mol/L,3×10-5mol/L時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同法,預(yù)孵高濃度DZP后,在濃度為 10-6mol/L,3×10-6mol/L,10-5mol/L,3×10-5mol/L時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 低濃度DZP對內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響

圖3 高濃度DZP對內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響

2.3 L-NAME、TEA 、4-AP、BaCl2對 低濃度DZP減弱5-HT誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮作用的影響 在內(nèi)皮完整的胸主動脈環(huán)上,對照組血管環(huán)出現(xiàn)一個峰值收縮,實(shí)驗(yàn)組預(yù)孵阻斷藥L-NAME、T EA、4-AP、BaCl2后減弱了 DZP減弱 5-HT誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮的作用,表現(xiàn)為收縮峰值的升高(P＜0.05)。詳見圖4。

2.4 L-NAME、TEA、4-AP、BaCl2對高濃度DZP減弱 5-HT 誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮作用的影響 在內(nèi)皮完整的胸主動脈環(huán)上,對照組血管環(huán)幾乎無收縮反應(yīng),實(shí)驗(yàn)組預(yù)孵阻斷藥L-NAME、BaCl2后減弱了DZP對血管環(huán)的收縮抑制作用,出現(xiàn)收縮反應(yīng),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而實(shí)驗(yàn)組預(yù)孵 TEA、4-AP后對血管環(huán)作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見圖4。

圖4 阻斷劑對低濃度、高濃度DZP減弱血管環(huán)收縮作用的影響

3 討 論

地西泮能降低人體動脈血壓[3],在離體胸主動脈環(huán)上,能松弛和抑制氯化鉀、氯化鈣、去甲腎上腺素、去氧腎上腺素引起的濃度依賴性的血管收縮,對血管平滑肌具有松弛作用[4,5]。

5-羥色胺為內(nèi)源性的血管活性因子,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì),同時又是重要的血管調(diào)節(jié)物質(zhì)。5-HT受體包括七個類型(5-HT1-5-HT7)[6]。目前,已知分布于大血管平滑肌上的5-HT受體主要為5-HT2A亞型,5-HT主要通過血管平滑肌的5-HT2A受體引起血管收縮。受體激動時,經(jīng)G蛋白的耦聯(lián)作用激活磷脂酶C(PLC),PLC促進(jìn)二磷酸磷脂酰肌醇水解產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DG)。IP3最初促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+貯存庫釋放Ca2+進(jìn)入胞漿,隨后由Ca2+的釋放誘發(fā)較長的細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。Ca2+與細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,復(fù)合物可結(jié)合于肌球蛋白輕鏈激酶并使之活化,導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈磷酸化和平滑肌收縮;DG在Ca2+存在下可激活蛋白激酶C(PKC),使蛋白質(zhì)或酶發(fā)生磷酸化,從而引起血管收縮[7,8]。本實(shí)驗(yàn)中,DZP使5-HT誘導(dǎo)的血管環(huán)的收縮作用減弱,提示DZP可能通過IP3-Ca2+信號通路和DG-PKC信號通路,阻滯內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流,減弱了5-HT對血管的收縮效應(yīng)。

血管平滑肌的舒縮功能可通過內(nèi)皮釋放的血管活性物質(zhì)來進(jìn)行調(diào)控,其中一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)是典型的內(nèi)皮釋放的血管活性物質(zhì),能產(chǎn)生強(qiáng)大的舒血管作用[9]。NO能刺激可溶性鳥苷酸環(huán)化酶,從而引起血管平滑肌環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平的增加,后者主要通過cGMP依賴性蛋白激酶使鈣內(nèi)流減少,增加鈣ATP酶對鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管舒張[10]。本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)DZP預(yù)處理,去內(nèi)皮的血管環(huán)引起血管收縮幅度的減弱明顯弱于內(nèi)皮完整的血管環(huán)。在內(nèi)皮完整的血管環(huán)上,L-NAME預(yù)處理后,減弱了DZP對血管環(huán)收縮作用的減弱,使收縮增強(qiáng),提示DZP對5-HT誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮作用的減弱可能與內(nèi)皮有關(guān),可能有NO途徑的參與。

K+通道活性的改變可使動脈平滑肌細(xì)胞膜電位去極化或超極化,是參與動脈血管舒縮調(diào)節(jié)的重要機(jī)制[11,12]。當(dāng)這些K+通道的活性受抑制時,可使細(xì)胞膜去極化,從而使電壓依賴性鈣通道開放,細(xì)胞外鈣內(nèi)流,細(xì)胞收縮而導(dǎo)致血管張力增加;相反其被活化時,可使細(xì)胞舒張而導(dǎo)致血管張力降低。本實(shí)驗(yàn)分別用TEA、4-AP、BaCl2阻斷鉀通道,低濃度DZP減弱了其對血管環(huán)收縮作用的減弱,使收縮增強(qiáng),提示低濃度DZP對5-HT誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮作用的減弱可能有KCa、KV、KIR通道的參與。高濃度DZP則只對BaCl2有作用,提示高濃度DZP對5-HT誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮作用的減弱可能只有KIR通道的參與。

DZP對5-HT誘導(dǎo)的成年大鼠離體胸主動脈環(huán)收縮具有減弱作用,其機(jī)制可能是通過IP3-Ca2+信號通路、DG-PKC信號通路或通過內(nèi)皮源性舒血管物質(zhì)或鉀離子通道使內(nèi)流入血管平滑肌細(xì)胞的Ca2+減少而發(fā)揮作用。5-HT對血管、血壓的影響還與5-HT1R有關(guān),DZP對和其相關(guān)的疾病及病變是否起到一定的治療作用,還有待進(jìn)一步研究。

[1]French JF,Rapopo rt RM,Matlib MA.Possible mechanism of benzodiazepine-induced relax ation of vascular smooth muscle[J].Cardiovasc Pharmacol,1989,14(3):405-411.

[2]陳修,陳維淵,曾貴云.心血管藥理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:202-204.

[3]Samuelson PN,Reves JG,Kouchoukos N T,et al.Hemody namic responses to anesthetic induction with midazolam or diazepam in patients with ischemic heart disease[J].Anesth Analg,1981,60:802-809.

[4]Ishii K,Kano T,Ando J.Pharmacological effects of flurazepam and diazepam on isolated canine arteries[J].JPN J Pharmacol,1983,33(1):65-71.

[5]Park SE,Sohn JT,Kim C,et al.Diazepam attenuates phenylephrine-induced contractions in rat aorta[J].Anesth Analg,2006,102(3):682-689.

[6]Hoyer D,Hannon JP,Martin GR,et al.M olecular,pharmacological and functional diversity of 5-HT recepto rs[J].Pharmacol Biochem Behav,2002,71(4):533-554.

[7]姚泰,喬健天.生理學(xué)[M].第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:370-374.

[8]姚泰,曹濟(jì)民,樊小力,等.生理學(xué)[M].第 1版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:34-46.

[9]Tanaka Y,Koike K,Toro L.MaxiK channel roles in blood vessel relaxations induced by endothelium-derived relaxing factors and their molecular mechanisms[J].J Smooth Muscle Res,2004,40(4-5):125-153.

[10]Vaandrager AB,de Jonge HR.Signalling by cGMP-dependent protein kinases[J].Mol Cell Biochem,1996,157(1-2):23-30.

[11]Nelson MT,Quayle JM.Phy siological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle[J].Am J Physio-Cell Physiology,1995,268(4):799-822.

[12]Jackson WF.Ion channels and vascular tone[J].Hypertension,2000,35(1):173-178.