田 源,楊 穎,杜文旭

病毒性心肌炎(VMC)是臨床較為常見的心血管疾病之一,心功能下降是病毒性心肌炎重要的病理特征。病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確,其中較為一致的觀點(diǎn)是病毒的直接損傷作用和免疫機(jī)制(包括病毒誘導(dǎo)的免疫和自身免疫反應(yīng))[1]。本實(shí)驗(yàn)通過多次腹腔注射柯薩奇B3m病毒稀釋液方式建立重復(fù)感染的VMC動(dòng)物模型,并測定小鼠外周血清白細(xì)胞介素(IL)-2的含量,旨在研究益氣溫陽、活血化瘀方對VMC小鼠外周血清IL-2的影響,為益氣溫陽、活血化瘀方臨床治療VMC提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性BALB/c小鼠120只,3周～4周齡,購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號:SCXK-(軍)]。

1.2 病毒 柯薩奇B3m病毒由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)克山病研究所提供,在Hela細(xì)胞中傳代,凍融 3次,離心(2 000 r/min)10次,上清液分裝,在Hela細(xì)胞中測50%組織感染率(TCID)為10-7,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥物 益氣溫陽、活血化瘀方主要由黃芪、人參、肉桂、附子、川芎、丹參、大青葉等組成。中藥經(jīng)水提取,制成浸膏,含水量為21%。用蒸餾水稀釋,調(diào)整濃度為82%,即相當(dāng)于1 mL懸液中含生藥4.3 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供。

1.4 動(dòng)物模型的復(fù)制及分組

1.4.1 小鼠慢性病毒性心肌炎的模型復(fù)制 分別于1 d、8 d、15 d、22 d、36 d、50 d 6次經(jīng)小鼠腹腔接種柯薩奇 B3m病毒稀釋液接種病毒?？瞻捉M于實(shí)驗(yàn)相同時(shí)點(diǎn)給予同體積的RM1640液。

1.4.2 試驗(yàn)分組 將存活慢性病毒性心肌炎小鼠120只,隨機(jī)分為模型組、空白組、中藥治療組,每組40只。

1.4.3 給藥方法 中藥組及西藥組于末次病毒感染后10 d灌胃,中藥組予益氣溫陽、活血化瘀方混懸液10.35 g/(kg?d)灌胃,空白組和模型組灌胃同體積生理鹽水。每日1次,灌胃4周。全部灌胃結(jié)束后模型組剩余33只,中藥組剩余39只,空白組剩余38只。

1.5 IL-2檢測 采用IL-2檢測試劑盒,購于北京晶美生物技術(shù)有限公司。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血IL-2活性,嚴(yán)格按照試劑盒操作方法進(jìn)行檢測。

1.6 形態(tài)學(xué)觀察 心臟標(biāo)本立即固定于4%多聚甲醛中,石蠟包埋切片,厚度為5 μ m,常規(guī)蘇木精-伊紅染色后進(jìn)行光鏡形態(tài)學(xué)觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組均數(shù)間的比較應(yīng)用方差分析,兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn),樣本率的比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變 空白組心肌纖維排列整齊,間質(zhì)血管無改變,未見心肌細(xì)胞變性、壞死;模型組心肌纖維排列紊亂、斷裂,心肌細(xì)胞肥大,空泡變性,血管充血出血,少量炎細(xì)胞浸潤,間質(zhì)纖維化明顯;中藥組心肌纖維排列紊亂較輕微,未見心肌斷裂,血管充血出血,少量炎細(xì)胞浸潤間質(zhì)纖維化程度輕微。

2.2 3組小鼠外周血IL-2水平比較 血清IL-2的含量模型組、中藥組與空白組比較明顯增高(P＜0.01);中藥組與模型組比較,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表1。

表1 3組小鼠外周血IL-2水平比較(±s)

表1 3組小鼠外周血IL-2水平比較(±s)

組別 n IL-2(pg/mL)空白組 38 18.01±1.09模型組 33 29.04±1.421)中藥組 39 23.37±0.981)2)與空白組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.01

3 討 論

眾多的臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),VMC的急性期、慢性期甚至在擴(kuò)張型心肌病的晚期均存在病毒的持續(xù)感染。T淋巴細(xì)胞作為免疫效應(yīng)細(xì)胞,其對病毒感染心肌細(xì)胞的攻擊是心肌壞死的機(jī)制之一,而IL-2是促使免疫效應(yīng)細(xì)胞分化、增殖的重要介質(zhì)。有研究表明,VMC遷延期或慢性期IL-2水平增高,IL-2是參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子[2]。Seko等[3]認(rèn)為,IL-2在體內(nèi)可誘導(dǎo)激活的T細(xì)胞損害已有炎癥的心肌細(xì)胞和未損傷的心肌細(xì)胞。故心肌損傷病理嚴(yán)重程度與血中IL-2的濃度密切相關(guān)[4]。

本實(shí)驗(yàn)顯示,中藥組的含量均較模型組明顯減低,但較空白組高,且中藥組的病理形態(tài)學(xué)改變明顯輕于模型組,說明益氣溫陽、活血化瘀方可減輕病毒感染所致的VMC自身免疫介導(dǎo)的心肌組織損傷,其作用機(jī)制可能主要為抑制IL-2過度分泌,從而對T細(xì)胞、細(xì)胞因子及NK細(xì)胞產(chǎn)生一系列的相關(guān)影響,減輕心肌細(xì)胞的損傷。但其確切作用機(jī)制則有待進(jìn)一步研究和探索。因此觀察病毒性心肌炎慢性期IL-2與心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系,可幫助了解到病毒性心肌炎的病理變化過程,為臨床治療病毒性心肌炎慢性期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]樸圣愛,王有鵬.羚桂龍牡顆粒對病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞外信號激酶1和2的影響[J].中藥信息,2009,26(1):77-78.

[2]劉強(qiáng),李樹雯,程志清.清心飲對 VMC小鼠細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2001,13(3):154-156.

[3]Seko Y,Yagita H,Okumura K,et al.T cell receptor VB gene expression in infiltrating cells in murine hearts with acute myocarditis caused by coxsackievirus B3[J].Circulalton,1994,89(5):2170.

[4]Kishimoto H,Yoshito R.Cytokine and murine Coxsackievirus B3myocarditis:Interleukin-2 suppressed myocarditis in the acute stage but enhanced the condition in the subsequent stage[J].Circulation,1994,89:2836-2842.