萬曉莉 （譯） 楊在賓 （校）

（摘自:Poultry Science，2005（84）：1851-1856；原文作者：Van Immerseel,F 等）

歐洲一項(xiàng)新法規(guī)規(guī)定，所有成員國(guó)必須執(zhí)行對(duì)家禽沙門氏桿菌的監(jiān)控 (EuropeanParliament等,2003a、b)。注射疫苗可以減少產(chǎn)蛋期母雞體內(nèi)的細(xì)菌定植和蛋的污染(Davies等,2003a;Van Immerseel等，2005)。由于肉仔雞飼養(yǎng)期短，不推薦使用疫苗 (Van Immerseel等，2005)。生產(chǎn)中常使用母源抗體和抗菌飼料添加劑，并結(jié)合衛(wèi)生檢測(cè)等聯(lián)合手段防控肉仔雞沙門氏桿菌的感染 (Methner等，1997；Van Immerseel等2002；Davies等，2003b)。

短鏈脂肪酸具有殺菌作用，生產(chǎn)中已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肉仔雞沙門氏桿菌的控制。市場(chǎng)上常用的短鏈脂肪酸有兩種制劑類型：無膜制劑和包膜酸制劑。無膜制劑即粉末或液體產(chǎn)品，主要添加到飼料或飲水中以殺滅其中的沙門氏桿菌，由于無膜制劑快速吸收，其作用僅限于嗉囊(Thompson等,1997)。所有對(duì)沙門氏桿菌有抗菌作用的酸都可以制成包膜制劑 (Al-Chalaby等，1985；Hume 等，1993；Moore 等，2004)。包膜或膠囊制劑需要用礦物質(zhì)或脂類做載體，將短鏈脂肪酸進(jìn)行包膜或膠囊處理，把酸帶到雞的腸道，使腸上皮細(xì)胞與酸直接接觸，同時(shí)這些酸可以改變腸內(nèi)微生物區(qū)系的組成，而且有利于在沙門氏桿菌誘發(fā)上皮細(xì)胞發(fā)病的關(guān)鍵部位，使酸與沙門氏桿菌密切接觸。因此，應(yīng)該科學(xué)選擇包膜處理的復(fù)合酸制劑，以發(fā)揮短鏈脂肪酸的殺菌或者更復(fù)雜的作用。有研究表明，包膜丁酸控制沙門氏桿菌定植的作用強(qiáng)于包膜甲酸，更優(yōu)于包膜乙酸(Van Immerseel等，2004a)。丁酸能抑制致病基因的表達(dá)和體外沙門氏桿菌對(duì)上皮細(xì)胞的入侵，乙酸則不能(Lawhon 等，2002；Van Immerseel等，2004b)。據(jù)了解，有關(guān)丁酸對(duì)雞沙門氏菌菌群作用的報(bào)道只有一項(xiàng)，是對(duì)無特定病原體（SPF）產(chǎn)蛋型雛雞的研究(Van Immerseel等，2004a)，對(duì)肉仔雞的研究還未見報(bào)道。

該研究通過兩個(gè)實(shí)驗(yàn)即實(shí)驗(yàn)一，比較了粉末和包膜丁酸制劑控制無特定病原體（SPF）雞早期口腔接種腸炎沙門氏桿菌在體內(nèi)定植的作用；實(shí)驗(yàn)二評(píng)估了包膜丁酸對(duì)從感染腸炎沙門氏桿菌到屠宰年齡的肉仔雞沙門氏桿菌定植的作用效果。

1 材料和方法

1.1 沙門氏桿菌

本研究所用76Sa88品系4型腸炎沙門氏桿菌，是從養(yǎng)禽場(chǎng)中分離的一個(gè)典型品系 (Desmidt等，1997、1998)，在溶菌肉湯（LB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，隨后在亮綠瓊脂培養(yǎng)基（BGA;Oxoid,Basingstoke,England）中培養(yǎng)稀釋10倍的細(xì)菌懸浮液，計(jì)算每毫升菌落形成單位數(shù)量，然后用磷酸鹽緩沖液稀釋到接種所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)雞

實(shí)驗(yàn)一：無特定病原體羅曼白雞 (Iffa-Credo,Brussels,Belgium)孵化雛雞，隔離舍飼。每次實(shí)驗(yàn)開始前，處死20只處于孵化期的雞，用抗腸炎沙門氏桿菌酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）(Desmidt等，1996)檢測(cè)其血清樣品中的腸炎沙門氏桿菌母源抗體，檢測(cè)結(jié)果均顯陰性。雞只自由飲用高壓滅菌水，自由采食照射飼料(采用 25 kGy of γ-irradiation 照射)，飼料中補(bǔ)充1.3節(jié)飼料添加劑。

實(shí)驗(yàn)二：選擇當(dāng)?shù)赝环趸瘓?chǎng)的接種疫苗的1日齡相同親本的羅斯肉仔雞。未檢測(cè)母源抗體，隨機(jī)分為兩組，每組50只。試驗(yàn)雞自由飲水，飼喂小麥基礎(chǔ)日糧。

1.3 飼料添加劑

兩種丁酸制劑：第一種是粉末丁酸鹽，含98%n-丁酸鈉鹽的白色或米黃色粉末；第二種是包膜丁酸鈉鹽：含30%正丁酸鈉鹽的微膠囊。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)一：無特定病原體羅曼白雞隨機(jī)分4個(gè)處理，每個(gè)處理25只，在孵化當(dāng)天檢測(cè)泄殖腔拭子沙門氏桿菌。從孵化當(dāng)天（雛雞1日齡），第1、2、3個(gè)處理組的日糧中分別添加0.63 g/kg粉末丁酸制劑、2.5 g/kg包膜丁酸制劑和復(fù)合丁酸制劑（0.315 g/kg粉末丁酸+1.25 g/kg包膜丁酸），3個(gè)處理組有效丁酸 (或鈉鹽)數(shù)量相同。第4個(gè)處理組為對(duì)照（不添加丁酸制劑）。第5 d，所有 SPF蛋雞用塑料管口腔接種 106CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌。第6 d，取泄殖腔拭子檢測(cè)沙門氏桿菌。第8 d，處死所有雞，從盲腸、肝臟和脾臟取樣進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)二：選擇1日齡羅斯肉仔雞100只，隨機(jī)分2個(gè)處理，每個(gè)處理50只。檢測(cè)所有雞的泄殖腔拭子沙門氏桿菌。從孵化當(dāng)天開始，處理1組飼喂以小麥為主的幼雛開口日糧，10 d后換成肉仔雞日糧。處理2飼料中添加2.5 g/kg包膜丁酸。孵化后第5 d，每個(gè)處理10只肉仔雞口腔接種105CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌。在第 6、9、13、20、27、34 和 41 日齡，對(duì)所有雞的泄殖腔拭子進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)。第42日齡，靜脈注射T61處死所有肉仔雞，從盲腸采樣進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)

泄殖腔拭子在亮綠瓊脂培養(yǎng)基上直接接種細(xì)菌，37℃培養(yǎng)過夜。直接接種后呈陰性，在緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基(Oxoid)中，37℃過夜培養(yǎng)預(yù)增菌，然后取1 ml加入9 ml亮綠肉湯培養(yǎng)基中(Oxoid)。培養(yǎng)過夜后，取1滴懸浮液，用亮綠瓊脂培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。計(jì)算沙門氏桿菌陽(yáng)性雞所占比例，用SPSS 10.0軟件進(jìn)行二元回歸分析統(tǒng)計(jì)，分析沙門氏桿菌陽(yáng)性雞所占比例在不同時(shí)間點(diǎn)的差異。

從盲腸、肝臟和脾臟采樣，使其均質(zhì)化，分別用5、10、20倍緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基稀釋液稀釋10倍。取每種稀釋液6×12 μl接種到亮綠瓊脂培養(yǎng)基上。過夜培養(yǎng)（37℃）后，對(duì)形成的菌落計(jì)數(shù)，以計(jì)算每克組織的菌落形成單位。對(duì)滴定后呈陰性的樣品預(yù)增殖或增殖，如前所述。用SPSS10.0軟件統(tǒng)計(jì)分析4個(gè)不同處理攜帶一定范圍細(xì)菌數(shù)的雞只數(shù)量的差異，如表1～表3所示。非參數(shù)秩合檢驗(yàn)（秩和檢驗(yàn)是非參數(shù)檢驗(yàn)中檢驗(yàn)效率比較高，而且又是最常用的一種方法）檢測(cè)固定誤差，非參數(shù)曼-惠特尼檢驗(yàn)（曼-惠特尼檢驗(yàn)又稱“曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)”，是由H.B.Mann等于1947年提出的。它假設(shè)兩個(gè)樣本分別來自除了總體均值以外完全相同的兩個(gè)總體，目的是檢驗(yàn)這兩個(gè)總體的均值是否有顯著的差別。）檢測(cè)組間的顯著差異(Maxwell等,1990)。

2 結(jié)果與討論

2.1 粉末和包膜丁酸制劑控制SPF雞早期口腔接種腸炎沙門氏桿菌在體內(nèi)定植的比較

泄殖腔拭子接種腸炎沙門氏桿菌之前雛雞呈陰性，感染后1 d的泄殖腔拭子檢測(cè)，沙門氏桿菌定植陽(yáng)性的雞只數(shù)量為：對(duì)照組10只，添加粉末丁酸組8只，包膜丁酸組4只，復(fù)合丁酸組3只（即實(shí)驗(yàn)一第6 d，取泄殖腔拭子檢測(cè)沙門氏桿菌得到的結(jié)果）。

表1 無特定病原體蛋雞5日齡口腔接種106CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌，8日齡時(shí)盲腸中腸炎沙門氏菌定植檢測(cè)①

表2 無特定病原體蛋雞5日齡口腔接種106CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌，8日齡時(shí)肝臟中腸炎沙門氏菌定植檢測(cè)①

表3 無特定病原體蛋雞5日齡口腔接種106CFU 76Sa88腸炎沙門氏桿菌，8日齡時(shí)脾臟中腸炎沙門氏菌定植檢測(cè)①

每克盲腸菌落形成單位的數(shù)目明顯不同，如表1所示。添加包膜丁酸或復(fù)合丁酸，盲腸中大于106CFU/g菌落明顯低于其他兩組（P＜0.05）。肝臟中菌落在所有處理中都較少（見表2），統(tǒng)計(jì)分析表明，飼料中添加復(fù)合丁酸，可使肝臟中大于103CFU/g菌落明顯少于其他處理（P＜0.05）。同時(shí)，添加復(fù)合丁酸，脾臟中大于104CFU/g菌落明顯低于（P＜0.05）對(duì)照組和添加粉末丁酸鹽處理組（見表3）。上述統(tǒng)計(jì)分析表明，不同處理在不同器官表現(xiàn)出菌落的雞只數(shù)分布不同。

2.2 飼料中添加包膜丁酸減少沙門氏桿菌在家禽腸道中定植和排泄的規(guī)律

對(duì)泄殖腔拭子檢驗(yàn)呈陰性的雞只，接種腸炎沙門氏桿菌后1周和3周（12和27日齡），對(duì)照組泄殖腔拭子直接培養(yǎng)后呈陽(yáng)性的肉仔雞所占比例分別增加到了35%和40%，而屠宰年齡時(shí)只有4.8%的雞直接培養(yǎng)呈陽(yáng)性。添加丁酸的試驗(yàn)組，接種腸炎沙門氏桿菌后1周和3周，直接培養(yǎng)后泄殖腔拭子檢驗(yàn)呈陽(yáng)性的雞只為15%，到屠宰年齡時(shí)下降到2.2%（見圖1）。顯著性檢驗(yàn)表明，第9日齡（P＜0.01）、第12和27日齡（P＜0.05），兩個(gè)處理間差異顯著。

圖1 在亮綠瓊脂培養(yǎng)基（圖1A）和預(yù)增殖后（圖1B）直接接種，泄殖腔拭子呈沙門氏桿菌陽(yáng)性的雞所占比例隨時(shí)間（日齡）的變化規(guī)律

對(duì)所有泄殖腔拭子呈沙門氏桿菌陽(yáng)性的雞只數(shù)目（包括正常飼養(yǎng)條件下陽(yáng)性者）的分析表明，在20日齡（種雞接種后15 d）時(shí)，對(duì)照組沙門氏桿菌陽(yáng)性的雞只數(shù)增加到97%，到屠宰年齡時(shí)下降到36%。而添加丁酸組，20日齡和屠宰年齡時(shí)陽(yáng)性的雞只數(shù)分別為48%和6%。自9日齡（接種后4 d）開始，兩處理組陽(yáng)性的雞只數(shù)差異顯著（P＜0.05）。

細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)表明兩組都有68%的肉仔雞在正常飼養(yǎng)條件下（沒有直接培養(yǎng)）呈沙門氏桿菌陽(yáng)性。

2.3 討論

經(jīng)研究表明，無特定病原體蛋雞感染腸炎沙門氏桿菌早期，包膜丁酸減少盲腸和內(nèi)臟菌落的作用強(qiáng)于粉狀丁酸。復(fù)合丁酸減少肝臟和脾臟菌落功效最好，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。由于非包膜丁酸被雞采食后從前消化道吸收，因此其作用僅限于嗉囊，包膜丁酸則可以進(jìn)入胃腸道后再釋放出丁酸(Thompson等,1997)。如果沒有無膜丁酸的殺菌作用，經(jīng)過嗉囊后仍存活的腸炎沙門氏桿菌到達(dá)腸道后，可能會(huì)形成菌落。而包膜丁酸則能夠影響腸道腸炎沙門氏桿菌菌落形成的部位。丁酸可以抑制致病基因的表達(dá)，降低腸炎沙門氏桿菌的侵襲力，從而減少盲腸細(xì)菌定植 (Porter等，1997；Lawhon等，2002；Van Immerseel等，2004b)。丁酸對(duì)腸道微生物區(qū)系組成的影響目前尚不明確。

飼料中添加丁酸可以明顯減少感染腸炎沙門氏桿菌的肉仔雞糞便中的菌落。實(shí)際上，直接培養(yǎng)和預(yù)增殖，菌落數(shù)目有很大不同。兩組菌落定植都隨時(shí)間減少。只有很少肉仔雞到屠宰年齡時(shí)有沙門氏桿菌定植。實(shí)驗(yàn)中，無特定病原體蛋雛雞飼料中添加包膜丁酸，可以減少感染早期盲腸菌落。盡管如此，到屠宰年齡時(shí)對(duì)照組和添加丁酸組菌落仍相同。因?yàn)楦腥驹缙谘a(bǔ)充丁酸組菌落定植少于對(duì)照組，盲腸菌落減少，可能會(huì)減少糞便中的排出；而且可以假設(shè)，肉仔雞感染早期盲腸菌落也會(huì)減少。在正常飼養(yǎng)條件下到達(dá)屠宰年齡，兩組肉仔雞雖然沒有高度定植，但是，肉仔雞大多都表現(xiàn)沙門氏桿菌陽(yáng)性。機(jī)體內(nèi)少量沙門氏桿菌是危害公眾健康的主要因素之一，因?yàn)榧S樣檢測(cè)陰性的雞在應(yīng)激條件下細(xì)菌可能會(huì)大量定植。而且，從我們的研究和很多其他研究均發(fā)現(xiàn)，完全消除雞的沙門氏菌非常困難(Berthelot-Herault等，2003；Beal等，2004；Van Immerseel等，2004c)。

3 結(jié)論

丁酸可以減少糞便中沙門氏桿菌的排出，進(jìn)而減少沙門氏桿菌對(duì)環(huán)境的污染。然而，只有實(shí)施衛(wèi)生檢測(cè)和各種防控措施相結(jié)合，才有可能實(shí)現(xiàn)沙門氏桿菌的完全消除。

21篇，刊略，需者可函索）