金樁 彭健 胡新文 林聲漢 馬燕

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）屬于乳桿菌屬，是腸道重要的益生菌，對維持胃腸道的生理功能有重要作用，被廣泛用于發(fā)酵食品與醫(yī)藥行業(yè)。但在飼料生產(chǎn)和養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用報道較少，為了探討嗜酸乳桿菌在畜牧業(yè)生產(chǎn)上的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用，本研究以產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的嗜酸乳桿菌-1.557菌株為試驗(yàn)菌，優(yōu)化了其培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分，給乳酸菌發(fā)酵飼料的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

嗜酸乳桿菌，由海南青牧原實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱(SHZ-A型，上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠生產(chǎn))、生化培養(yǎng)箱 (DHP120型，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠生產(chǎn))、高壓滅菌器(MLS-3750型，日本三洋電子有限公司生產(chǎn))、磁力攪拌器(JB-3型，上海智光儀器儀表有限公司生產(chǎn))、便攜式pH計(PHB-3型，上海偉業(yè)儀器廠生產(chǎn))、生物潔凈工作臺(SA-960-2型，上海上凈凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn))、721可見紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)改良基）：蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、牛肉膏 10 g、葡萄糖 20 g、乙酸鈉 5 g、檸檬酸銨 2.15 g、Tween801 ml、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、K2HPO42 g、瓊脂粉 17 g、水 1000 ml。

1.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

菌種活化：從冰箱中取出嗜酸乳桿菌-1.557斜面菌種，室溫靜置40min。然后從中取兩環(huán)菌種接于裝有10ml液體種子培養(yǎng)基試管中，37℃靜止培養(yǎng)12 h，備用。

1.4.1 靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)對比

按1.0%接種量將活化的種子接種于裝有100 ml MRS改良液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)和60 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，每隔12 h取1次樣(先搖勻后取樣)，在610 nm處（以下同）測定培養(yǎng)液OD值。

1.4.2 培養(yǎng)基起始pH值的篩選

以6 mol/l的HCl和40%NaOH溶液將MRS改良培養(yǎng)基的起始pH值分別調(diào)節(jié)為4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，接入1.0%活化菌液，37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，測定OD值。

1.4.3 培養(yǎng)溫度的篩選

將100 ml的MRS改良液體培養(yǎng)基中接入1.0%的菌液，分別于 30、35、40、45 ℃下恒溫培養(yǎng) 24 h，測定OD值。

1.4.4 接種量的確定

按 0.5、1.0、1.5、2.0%接種量接活化菌液，37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h，測定OD值。

1.5 對培養(yǎng)基成分的優(yōu)化（見表1）

表1 L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計

蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏和葡萄糖是影響培養(yǎng)基的主要成分。因此，本試驗(yàn)設(shè)計L16（45）正交試驗(yàn)，確定嗜酸乳桿菌-1.557最適培養(yǎng)基成分。

1.6 測定方法

OD值測定采用胡俊等（2007）方法；活菌數(shù)測定參考郭興華（2002）方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)

不同時間取樣測定培養(yǎng)液OD610值，結(jié)果見表2、圖1。

表2 嗜酸乳桿菌-1.557靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)下不同取樣時間OD610值對比

圖1 乳酸桿菌-1.557靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)對比

從表2和圖1可知，試驗(yàn)剛開始時兩種培養(yǎng)方法的OD610值一樣，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸變大，0～12 h時間段迅速生長，12～24 h時間段緩慢生長，到24 h時臨近頂峰值，而后進(jìn)入衰退期；整個培養(yǎng)階段，靜置培養(yǎng)優(yōu)于搖床培養(yǎng)。這說明嗜酸乳桿菌-1.557的最適培養(yǎng)時間為24 h，并且該菌是兼性厭氧菌。這符合乳酸菌多數(shù)屬于厭氧菌或微好氧菌的結(jié)論。

2.2 培養(yǎng)基起始pH值的確定（見表3）

從表3可以看出，嗜酸乳桿菌-1.557對酸堿環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，pH值4.5～8.5都可以生長。當(dāng)pH值小于5.5或大于7.5時生長較慢，而在pH值5.5～7.5范圍內(nèi)生長較快。pH值5.5時OD610值達(dá)到最高值1.815，即培養(yǎng)基的最適初始pH值為5.5。大量研究表明，乳酸菌在pH值4.5～8.0范圍內(nèi)生長良好，本試驗(yàn)結(jié)果在此范圍內(nèi)。

表3 培養(yǎng)基不同起始pH值對嗜酸乳桿菌-1.557生長的影響

2.3 培養(yǎng)溫度的確定（見表4）

表4 不同培養(yǎng)溫度對嗜酸乳桿菌-1.557生長的影響

從表4可以看出，培養(yǎng)溫度在30℃時OD610值為1.826，到35℃時提高到1.861，而超過35℃后，隨著溫度的升高OD610值有下降趨勢，到45℃時僅為0.122。說明嗜酸乳桿菌-1.557最適培養(yǎng)溫度為35℃，而且在高溫條件下嗜酸乳桿菌-1.557基本不生長。單春喬等（2009）對嗜酸乳桿菌SR-1菌株分泌類細(xì)菌素的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，該菌株適宜溫度為37℃。奚灝鏘等（2009）研究結(jié)果說明其保存的嗜酸乳桿菌適宜溫度為36℃。熊素玉等（2006）用改良MC培養(yǎng)基為載體，做了分離到的24株乳酸菌最適條件研究，發(fā)現(xiàn)最適生長溫度大概在40℃左右，但溫度的范圍在各菌株間略有差異。

2.4 接種量的確定（見表5）

表5 不同接種量對嗜酸乳桿菌-1.557生長的影響

從表5可以看出，隨著接種量的增加，OD610值也逐漸變大。當(dāng)接種量為0.5%時OD610值為1.319；接種量為1.0%時OD610值提高到1.812，有明顯升高。而1.0、1.5、2.0%的接種量菌液OD610值差異不明顯，從生產(chǎn)成本考慮本次試驗(yàn)采用了1.0%的接種量。李劍芳等（2003）通過正交設(shè)計試驗(yàn)確定最優(yōu)發(fā)酵條件是乳酸菌接種量為1%；邵亞東等（2007）為制備高濃度乳酸菌發(fā)酵劑，用1%接種量可以使乳酸菌活菌數(shù)的對數(shù)值達(dá)到 8～9。

2.5 最適培養(yǎng)基成分的確定（見表6）

從表6可以看出，在最佳條件（溫度35℃，時間24 h，接種量為1.0%）下，組合A1B4C4D4（蛋白胨6 g、酵母提取物6 g、牛肉膏12 g、葡萄糖22 g）測出的OD610值最大，即1.870。但經(jīng)過統(tǒng)計分析得出，嗜酸乳桿菌-1.557最佳培養(yǎng)基成分組合為A3B4C4D1（蛋白胨10 g、酵母提取物6 g、牛肉膏12 g、葡萄糖16 g）。因?yàn)樵摾碚摋l件下的組合不在實(shí)際操作組合，所以需要再進(jìn)行一次驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，A3B4C4D1組OD610值為 1.889，大于 A1B4C4D4組 合 OD610值（1.870），即嗜酸乳桿菌-1.557最適生長培養(yǎng)基成分為蛋白胨10 g、酵母提取物6 g、牛肉膏12 g、葡萄糖16 g，影響因素次序?yàn)榻湍柑崛∥铮九Ｈ飧啵镜鞍纂耍酒咸烟恰?/p>

表6 培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 嗜酸乳桿菌-1.557生長曲線（見表7和圖2）

表7 嗜酸乳桿菌-1.557不同培養(yǎng)時間OD610值和活菌數(shù)

圖2 嗜酸乳桿菌-1.557生長標(biāo)準(zhǔn)曲線

從表7和圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌液OD值和活菌數(shù)都得到提高。當(dāng)培養(yǎng)24 h時，菌液OD值達(dá)到1.889，活菌數(shù)達(dá)到2.9×1010cfu/ml。奚灝鏘等對一株嗜酸乳桿菌進(jìn)行優(yōu)化研究，活菌數(shù)也達(dá)到了1010cfu/ml，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。

在生產(chǎn)菌種和乳酸菌制劑時，菌液中乳酸菌數(shù)量的多少直接影響到產(chǎn)品的總體質(zhì)量。乳酸菌菌體小，在光學(xué)顯微鏡下不易直接計數(shù)，大多數(shù)采用平板涂布培養(yǎng)法。而平板涂布培養(yǎng)法培養(yǎng)的時間較長，不適于生產(chǎn)中應(yīng)用，所以，平板涂布培養(yǎng)法可以用于終端產(chǎn)品的檢測，但對生產(chǎn)過程的監(jiān)控起不到作用。制作嗜酸乳桿菌-1.557生長標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用分光光度計測定OD值，簡單方便，可以隨時取樣檢測培養(yǎng)液活菌數(shù)，對生產(chǎn)進(jìn)行全過程監(jiān)控，隨時調(diào)整培養(yǎng)條件，為保證產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。

3 結(jié)論

3.1 嗜酸乳桿菌-1.557最佳培養(yǎng)條件為：溫度35℃、培養(yǎng)時間24 h、接種量1.0%、培養(yǎng)基起始pH值5.5。

3.2 優(yōu)化培養(yǎng)基成分為蛋白胨10 g、酵母提取物6 g、牛肉膏12 g、葡萄糖16 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸銨 2.15 g、Tween801 ml、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、K2HPO42 g、瓊脂粉 17 g、水 1000 ml。

3.3 優(yōu)化培養(yǎng)后菌液OD610值達(dá)到1.889，活菌數(shù)達(dá)到 2.90×1010cfu/ml。

11篇，刊略，需者可函索）