胡記妹，曾軍榮，梁海燕，鄺家熙

（廣東省從化市中心醫(yī)院檢驗科，廣東從化 510900）

甲真菌病（onychomycosis）是南方地區(qū)最常見的甲病，通常認(rèn)為甲真菌病在人群中的發(fā)病率為3%～5%[1]，占真菌病的20%～30%[2]。甲屑直接鏡檢和真菌培養(yǎng)是公認(rèn)的診斷甲真菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但受取材的質(zhì)和量等因素的影響，兩者結(jié)合診斷的陽性率＜70%[3]。近年來開展了剪取病甲做組織病理學(xué)檢查[4]及PCR檢測[5]，使查菌的陽性率得以提高，但卻存在制作復(fù)雜、耗時長等缺點，限制了它們的推廣。臨床上迫切需要一種準(zhǔn)確、簡便、快速、價廉、易行的方法用于甲真菌病的診斷。為探索一種操作簡易、實驗結(jié)果可靠的檢驗方法診斷甲真病，筆者采用20%KOH浸軟病甲真菌鏡檢（簡稱浸軟法）從甲標(biāo)本中檢測真菌，并與直接鏡檢法、真菌培養(yǎng)法（簡稱培養(yǎng)法）進行比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料

121例均為2006年9月～2009年10月來我院皮膚科門診就診的患者，入選患者均符合甲真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。其中，男 59例，女 62例；年齡 17～65歲，病程 30 d～24年，平均4.2年。觀察病甲數(shù)目432份，靶甲數(shù)目121份，伴手足癬38例，有甲板外傷史12例。受檢前1個月內(nèi)均未接受過局部和系統(tǒng)抗真菌藥物治療。

1.2 標(biāo)本采集

以75%酒精消毒病甲表面后，用消毒手術(shù)刀刮棄表層甲屑，刮取和剪取擬診為甲真菌病的靶甲及甲下碎屑，分為3份，其中，81份病甲標(biāo)本取自遠(yuǎn)端側(cè)緣甲下型，40份取自全甲毀損型。

1.3 方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)

刮取其病甲遠(yuǎn)端邊緣和甲床皮屑進行傳統(tǒng)的KOH直接鏡檢[6]，同時剪取病損指、趾甲末端少許標(biāo)本做浸軟法真菌鏡檢和真菌培養(yǎng)。3份標(biāo)本分別按下述3種方法處理：

1.3.1 直接鏡檢法 取刮下甲屑于載玻片上，加10%KOH 1滴溶解，10 min后觀察，Olympus光學(xué)顯微鏡下見菌絲和（或）孢子者為陽性。皮膚癬菌：菌絲較細(xì)、規(guī)則、分隔、分枝，可見關(guān)節(jié)孢子。酵母菌：可見酵母細(xì)胞團、芽生孢子及假菌系。真菌：菌絲粗大，不規(guī)則，可見特殊結(jié)構(gòu)。

1.3.2 培養(yǎng)法 采用兩管法，即甲屑同時接種于含氯霉素和放線菌酮的沙氏培養(yǎng)基與含氯霉素、不含放線酮的沙氏培養(yǎng)基（以上培養(yǎng)基均為自制），每管最少接種3點，置25～27℃培養(yǎng)，隨時觀察培養(yǎng)情況。4周以上無菌落生長判定為陰性，有菌落生長者，皮膚癬菌及真菌的鑒定主要依據(jù)菌落形態(tài)、顏色等以及Olympus光學(xué)顯微鏡鏡檢鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《醫(yī)學(xué)真菌學(xué)——實驗室檢驗指南》[7]，念珠菌屬用API20cAux試劑盒（法國BioMerieux公司）鑒定到種。

1.3.3 浸軟鏡檢法 將病甲標(biāo)本置入20%KOH溶液中56℃40～50 min，待病甲標(biāo)本完全浸透軟化呈蛋白胨狀，吸出多余的KOH液后，將標(biāo)本放在載玻片上，用蓋玻片輕輕將標(biāo)本壓平、壓薄呈云霧狀或毛玻璃狀，在Olympus光學(xué)顯微鏡下見菌絲和（或）孢子者為陽性。皮膚癬菌：菌絲較細(xì)、規(guī)則、分隔、分枝，可見關(guān)節(jié)孢子。酵母菌：可見酵母細(xì)胞團、芽生孢子及假菌系。真菌：菌絲粗大，不規(guī)則，可見特殊結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件分析，行χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直接鏡檢法結(jié)果

121例擬診患者甲標(biāo)本中，真菌陽性者58例（47.9%）。

2.2 培養(yǎng)法結(jié)果

121例擬診患者甲標(biāo)本培養(yǎng)出72例（59.50%）共80株真菌，單一感染69例（95.83%），混合感染3例（4.17%）。菌種分布情況見表1。

表1 121例甲真菌病真菌培養(yǎng)結(jié)果Tab.1 The results of 121 onychomycosis by fungal culture

2.3 浸軟鏡檢法

121例擬診患者甲標(biāo)本中，118例（97.52%）檢出真菌成分，檢查結(jié)果：孢子、菌絲形態(tài)初步提示為皮膚癬菌110例（91%），初步提示為酵母菌36例（30%），初步提示為真菌48例（38%）。其中2種或2種以上真菌混合24例。

3種方法檢出結(jié)果見表2。

表2 121例疑甲真菌病3種方法檢查結(jié)果[n(%)]Tab.2 The results of 121 onychomycosis by three tests[n(%)]

三種方法檢出率差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=75.247，P＜0.001），直接鏡檢法與培養(yǎng)法檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.258，P＞0.05）。浸軟法鏡檢檢出率高于直接鏡檢法，兩者比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=51.829，P＜0.001）；浸軟法檢出率高于培養(yǎng)法，兩者比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義 （χ2=75.00，P＜0.001）。

3 討論

甲真菌病指甲板、甲床和甲周圍組織的真菌感染，國內(nèi)發(fā)病率約為15.6%[8]，是皮膚科常見病、多發(fā)病，但誤診、漏診患者時有發(fā)生，在系統(tǒng)治療前，采用切實可行的診斷方法證實甲真菌感染十分重要。筆者采用直接鏡檢法、真菌培養(yǎng)及浸軟鏡檢法進行了對比研究，結(jié)果顯示，浸軟鏡檢法明顯高于直接鏡檢法和真菌培養(yǎng)，與文獻(xiàn)報道一致。

雖然傳統(tǒng)的KOH直接鏡檢法和真菌培養(yǎng)操作簡單，但陽性率較低，分別為50%～75%和25%～80%[9]，容易出現(xiàn)假陰性；組織病理法陽性率為99.44%[10]，但要求條件高、操作復(fù)雜、時間長。直接鏡檢檢出率較低，本研究中直接鏡檢檢出58例（47.9%），但該方法快速、方便，可直接明確有無真菌感染。真菌培養(yǎng)雖為診斷甲真菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于無活性休眠菌絲及甲標(biāo)本暴露于空氣中，污染機會較多，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，造成培養(yǎng)陽性率低。培養(yǎng)法耗時雖較長，但可鑒定菌種，進行藥敏試驗對藥物的選擇有一定的指導(dǎo)意義，如克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥。組織病理法陽性率高于直接鏡檢和培養(yǎng)法，能觀察到真菌在甲中寄生的狀況，可對病原菌作出初步分類，并可對銀屑病等病甲明確診斷，但要求條件高、操作復(fù)雜、時間長，因真菌在病甲內(nèi)分布稀疏不均，往往需要多層面切片尋找方可避免假陰性結(jié)果，鏡下菌體往往呈橫斷面或節(jié)段狀，還需特殊染色（PAS染色）方易區(qū)別，甲切片對切片刀磨損大，制片過程需1周，對實驗人員的實驗組織病理學(xué)技術(shù)要求較高，使該法推廣受限。浸軟法真菌鏡檢與甲組織病理法比較，具有患者無痛苦、操作簡便、經(jīng)濟、快速、鏡下病甲內(nèi)的真菌生長形態(tài)完整、無需特殊染色、低倍鏡下即可觀察到病甲內(nèi)原始狀分布的菌絲或關(guān)節(jié)菌絲的特點。張文娟等[11]提出應(yīng)用KONCPA法診斷甲真菌病，筆者對此法進行了研究，20%KOH浸軟鏡檢法是一種檢出率高、可行性強的甲真菌病診斷方法。結(jié)果提示，組織病理學(xué)檢查和20%KOH溶甲法可彌補甲真菌病診斷中真菌直接鏡檢和真菌培養(yǎng)法的不足，顯著提高診斷陽性率和準(zhǔn)確率。該法較甲病理法[9]診斷甲真菌病簡便、快速，易于操作，門診患者可無需固定步驟，制作濕片即可行鏡下觀察出報告，完成1份標(biāo)本所需時間為1 h左右，在日益繁忙的皮膚性病科門診中具有推廣價值，建議臨床推廣應(yīng)用。

[1]余進,李若瑜.國內(nèi)甲真菌病病原學(xué)的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國真菌學(xué)雜志,2006,1(1):63-64.

[2]Haneke E,Roseeuw D.The scope of onychomycosis:epidemiology and clinical feature[J].Int JDermatol,1999,38(Suppl 2):7-12.

[3]Daniel CR.The diagnosis of nail fungal infection[J].Arch Dermatol,1991,12(7):1566-1567.

[4]牛云彤,李少平.甲真菌病的診斷[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2004,20(1):57-58.

[5]李筱芳,田偉,王紅,等.多重PCR快速診斷甲真菌病[J].國際皮膚性病學(xué)雜志,2007,33(4):197.

[6]王光超.皮膚病及性病學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2002:264.

[7]王端禮.醫(yī)學(xué)真菌學(xué)——實驗室檢驗指南[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:137-289.

[8]中華醫(yī)學(xué)會皮膚病學(xué)分會.皮膚科就診患者足病情況調(diào)查[J].中華皮膚科雜志,2000,33(1):55.

[9]張文娟,蔡永明,桑菊花,等.甲真菌病組織病理學(xué)檢查及其意義[J].中華皮膚科雜志,1996,29(5):352-353.

[10]Liu HN,Lee DD,Wong C,et al.A new method for diagnosing tinea unguium[J].Dermatology,1993,18(7):166.

[11]張文娟,蔡永明,桑菊花,等.改良KONCPA法診斷甲真菌病的研究[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志,1997,20(4):254.