鄒明靜,王娜*

(菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校,山東 菏澤 274030;*商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校)

液相免疫體系膠體金粒徑的選擇及其應(yīng)用

鄒明靜,王娜*

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校,山東 菏澤 274030;*商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

目的探討不同粒徑的金顆粒標(biāo)記對液相免疫測定體系的影響。方法制備10、21、50nm三種不同粒徑的金納米顆粒并用于標(biāo)記人絨毛膜促性腺激素(hCG)抗體,采用分光光度法和共振散射光譜法對金標(biāo)抗和膠體金標(biāo)記的免疫復(fù)合物分析測定。結(jié)果10nm的膠體金標(biāo)記體系具有較好的標(biāo)記效率,工作曲線線性關(guān)系良好,用于實際樣品測定,結(jié)果滿意。結(jié)論膠體金標(biāo)記的液相免疫共振散射光譜法測定體系宜選用粒徑8～15nm的金顆粒。

膠體金標(biāo)記;共振散射;人絨毛膜促性腺激素

氯酸金在還原劑的作用反應(yīng)下聚集形成金納米顆粒,由于顆粒間相互排斥的靜電作用和布朗運動,使其保持在相對穩(wěn)定的水溶膠狀態(tài),即膠體金。金顆粒因為其獨特的物理特性成為近年來研究的熱點,由于其具有高電子密度,可以吸附抗體或staphylococcus protein A(SPA),形成抗體與金顆粒的結(jié)合體,從而實現(xiàn)對抗體的標(biāo)記,將其應(yīng)用于特異性免疫反應(yīng),實現(xiàn)對抗原或抗體物質(zhì)的定位、定性乃至定量研究,即金標(biāo)記技術(shù)[1]。目前臨床檢驗中常采用固相斑點免疫金滲濾法、免疫層析法對抗原、抗體進(jìn)行分析檢測[2]。對于液相體系中的不同粒徑的膠體金聚集的研究仍較少。共振散射光譜法利用復(fù)合體系中締合微粒的聚集導(dǎo)致共振散射強度的增強,從而建立共振散射強度與待測物濃度的線性關(guān)系進(jìn)行測定,目前廣泛運用于對痕量無機物和有機物如核酸、蛋白質(zhì)的分析[3-4]。為此,我們研究液相體系中不同粒徑的金顆粒以及免疫金復(fù)合物的的共振散射效應(yīng),以標(biāo)記hCG為例,考察不同粒徑的金顆粒標(biāo)記對免疫測定的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 756型紫外-可見分光光度計(上海棱光);RF-540型熒光分光光度計(日本島津);84-Ⅱ磁力加熱攪拌器(山東精佳儀器廠);KQ-500ED超聲波清洗器(江蘇昆山);HAuCl4(國藥集團化學(xué)試劑公司):1.0%;檸檬酸鈉:1.0%;hCG兔抗多克隆抗體(上海中科生物技術(shù)有限公司):hCG(麗珠集團麗珠制藥廠):3.0×103mIU/ml;30.0%PEG6000,100mg/ml KCl;pH 2.6～7.8的檸檬酸-NaH2PO4緩沖溶液。

1.2 膠體金的制備與質(zhì)量鑒定 采用檸檬酸鈉改良法制備膠體金[5]。步驟如下:將新制備的亞沸高純水100ml置于錐形瓶內(nèi)煮沸;分別加入1.0%檸檬酸鈉溶液4.00ml,2.00ml 1.00ml,繼續(xù)煮沸約5min;在磁力加熱攪拌器加速攪拌的同時,快速加入1.0%HAuCl4溶液1.00ml,繼續(xù)煮沸15min;冷卻,定容至100ml,密封保存。對以上方法制備的膠體金(58.0μ g/ml)可采用透射電鏡、分光光度法進(jìn)行鑒定。可通過透射電鏡觀察金顆粒的大小和形貌,在1ml 1.0%HAuCl4溶液分別加入1.0%檸檬酸鈉溶液4.00ml、2.00ml、1.00ml可獲得 10、21、50nm 球形的金納米顆粒[6-9]。彭劍淳等人報道在10～90nm粒徑范圍內(nèi),膠體金顆粒粒徑d與最大吸收峰波長λ max之間存在直線回歸關(guān)系[10],實驗中常采用分光光度法控制膠體金吸收峰在517nm～526nm之間獲得合適粒徑的膠體金顆粒。

1.3 金標(biāo)兔抗hCG的制備

1.3.1 膠體金pH值的調(diào)節(jié) 試驗在不同pH值對于膠體金體系的影響,采用共振散射光譜法確定最適pH值。移取1.00ml膠體金(58.0μ g/ml)于5ml的刻度試管中,加入一定量的0.1mol/L的HCl溶液或0.1mol/L的K2CO3溶液,將膠體金pH調(diào)節(jié)至4.0～ 9.0,再分別加入 20.0μ l的兔抗 hCG,放置 5min,加入0.1ml 10%KCl,放置約 2h,稀釋至3ml,測定560nm處的散射光強度。當(dāng)pH小于5.5時,膠體金在KCl溶液的作用下發(fā)生了聚集,散射光強度較大;當(dāng)pH大于5.5時,兔抗hCG包裹了膠體金,KCl溶液不能使膠體金聚集,散射光強度趨于穩(wěn)定。本文選擇了pH 7.0,即1.00ml膠體金(58.0μ g/ml)約需加入18μ L 0.1mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)至所需pH值[7]。

1.3.2 兔抗hCG用量的確定 移取1.00ml膠體金(58.0μ g/ml)于 5ml的刻度試管中 ,加入 18.0μ L 0.1mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH約為7.0,分別加入兔抗hCG 0μ L 、5.0μ l、10.0μ l、15.0μ l、20.0μ l、25.0μ l、30.0μ l。5min 后均加入 0.1ml 10%KCl溶液 ,混勻后靜置2h,稀釋至3ml,測定不同濃度下的吸光度值。在10,21nm的膠體金中,當(dāng)加入兔抗hCG量小于10.0μ l時,溶液的顏色呈紫紅色,吸光度值較大。而當(dāng)兔抗 hCG 大于 10.0μ l(12.0～ 30.0μ l)時,吸光度值趨于穩(wěn)定。采用共振散射光譜法確定不同粒徑的金顆粒得以穩(wěn)定的最適抗體量。對于10、21nm的膠體金體系 ,試分別以 12.0μ l、15.0μ l、18.0μ作為1.00ml膠體金的標(biāo)記量并按實驗方法優(yōu)化條件,當(dāng)標(biāo)記量為12.0μ l時,由于少量的金顆粒未被包裹,各體系的空白值較大;以 18.0μ l標(biāo)記,由于蛋白質(zhì)過量,各體系的線性相關(guān)性差,靈敏度低;以15.0μ l標(biāo)記,可獲得較好的線性關(guān)系[7]。故選擇 15.0μ l兔抗hCG為1.00ml膠體金的最低穩(wěn)定量。在50nm的膠體金體系中,兔抗hCG量增大,而當(dāng)兔抗hCG大于15.0μ l(18.0～ 30.0μ l)時,吸 光度值趨于穩(wěn)定 。故選擇20.0μ l兔抗hCG 為其1.00ml膠體金的最低穩(wěn)定量。

1.3.3 兔抗hCG的膠體金標(biāo)記 取90ml的膠體金溶液,加入約1.40ml 0.1mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值約7.0。在磁力攪拌下,一定量的兔抗hCG溶液,繼續(xù)攪拌10min,再加入1.50ml 3.0%的聚乙二醇20000作為穩(wěn)定劑(其最終濃度約為0.05%),后攪拌30min,4℃保存。

1.4 測定方法 在5ml的刻度試管中,依次移取一定量pH 5.0檸檬酸-NaH2PO4緩沖溶液,1.0ml的金標(biāo)記兔抗 hCG溶液,一定量hCG溶液,一定量PEG溶液,定容至3ml,混勻,于超聲波反應(yīng)器中反應(yīng)30min。用熒光分光光度計低靈敏檔,縱坐標(biāo)為5,在λ ex-λ em=Δ λ=0條件下同步掃描獲得同步發(fā)射光譜。測定560nm波長處的共振散射光強度I560nm,并測定其空白值(IRS)b,計算 Δ I560nm=(I560nm)b-I560nm。

2 結(jié)果

2.1 共振散射光譜 膠體金在360nm,470nm,560nm處出現(xiàn)了較強的同步散射峰,560nm處的同步散射峰較強且隨膠體金濃度的增加發(fā)生紅移且存在共振散射的猝滅效應(yīng)(圖1)。用膠體金標(biāo)記兔抗hCG后,同步散射信號有微弱增強,光譜圖峰形無明顯的變化。在適宜的緩沖條件下,當(dāng)金標(biāo)記兔抗hCG與hCG發(fā)生特異性反應(yīng)生成免疫復(fù)合物,在360nm、470nm、560nm也存在明顯的同步散射峰,560nm處的同步散射峰較強。隨著hCG濃度的增加,聚集的金標(biāo)記兔抗hCG量不斷減少,溶液中微粒趨于分散,體系的散射光強度線性減弱且發(fā)生藍(lán)移(圖2)。已知該儀器的最強發(fā)射位于470nm,故膠體金,金標(biāo)記兔抗hCG在360nm,560nm;金標(biāo)記兔抗hCG與hCG發(fā)生特異性反應(yīng)后在360nm,560nm出現(xiàn)的同步散射峰均為共振散射峰。實驗選取波長為560nm進(jìn)行測定。

2.2 免疫反應(yīng)的條件的確定 本文考察了檸檬酸-NaH2PO4緩沖溶液(pH=2.2～8.0);金標(biāo)記兔抗hCG用量;聚乙二醇用量以及溫育時間對10,21,50nm的膠體金免疫體系的影響[8-9]。實驗表明,對于10nm的膠體金免疫體系,在0.50mL pH5.0檸檬酸-NaH2PO4緩沖溶液,選取1.0ml的金標(biāo)記兔抗hCG,40mg/ml PEG6000對體系的增敏效果較好。對于21,50nm的膠體金免疫體系,在0.40mL pH5.0檸檬酸-NaH2PO4緩沖溶液,選取0.75ml的金標(biāo)記兔抗hCG,50mg/ml PEG4000對體系的增敏效果較好,并置于超聲波反應(yīng)器中反應(yīng)約25min。以最佳實驗條件,測定不同體系的hCG濃度對應(yīng)的共振散射強度 I560nm(ΔI560nm=(I560nm)b-I560nm)。以chCG對Δ I560nm作圖,獲得不同體系的工作曲線,回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表1。小粒徑的膠體金體系,可以獲得較寬的線性范圍,較大粒徑的膠體金體系,靈敏度稍高但線性范圍較窄,對于50nm的膠體金體系的線性關(guān)系較差。實驗表明:小粒徑金顆粒體系更利于液相膠體金體系的測定[8-9]。

表1 工作曲線

2.3 尿樣品的檢測 取孕婦尿液10份,以轉(zhuǎn)速3500。離心30min,準(zhǔn)確移取 300μ l上清液。采用10nm的膠體金體系,按實驗方法測定,并與免疫分光光度法比較,做方法分析結(jié)果的回歸分析,其相關(guān)系數(shù)、斜率和截距分別為0.99、1.01和662mIU/ml,采用相關(guān)系數(shù)檢驗法對其回歸方程進(jìn)行檢驗,結(jié)果表明以上兩種方法的線性相關(guān)且相關(guān)性好[8-9]。

3 討論

膠體金溶液中若加入KCl溶液,金顆粒會發(fā)生聚集,散射光強度顯著增強。若在膠體金溶液加入適量的蛋白,如兔抗hCG,金顆粒被兔抗hCG緊密包裹獲得金標(biāo)抗hCG,其可在一定濃度的KCl,PEG溶液中均可穩(wěn)定存在。而在一定的緩沖條件下,在高濃度的PEG作用下,金標(biāo)記兔抗hCG可發(fā)生松散的聚集,散射光強度顯著增強。當(dāng)hCG不斷加入,液相中的金標(biāo)記兔抗hCG與hCG發(fā)生特異性反應(yīng)生成免疫復(fù)合物,散射峰藍(lán)移,散射光強度降低。金顆粒在PEG的作用下進(jìn)一步聚集并發(fā)生沉積,故溶液中的金標(biāo)記兔抗hCG量減少,hCG在一定濃度范圍內(nèi)與散射光強度降低值存在良好的線性關(guān)系,不需要相分離,據(jù)此可建立hCG的免疫共振散射光譜法[8-9]。在此方法的建立中,主要分為三個步驟,即膠體金的制備、膠體金的標(biāo)記,檢測條件的優(yōu)化,而以膠體金的粒徑的選擇最為關(guān)鍵。

本實驗采用改良的檸檬酸鈉法制備膠體金顆粒。采用高純水,保持其他的條件恒定,僅改變檸檬酸鈉的量獲得不同粒徑的膠體金。當(dāng)加入檸檬酸鈉的量在4.0～1.0ml,均能獲得均一、穩(wěn)定的紅色膠體金溶液。金顆粒在一定的范圍內(nèi)與共振散射強度值存在良好的線性關(guān)系并隨濃度的增大,最大的吸收峰發(fā)生紅移(圖1),但當(dāng)金顆粒的濃度大于一定的濃度時,如10nm 的金顆粒,當(dāng)其濃度大于35.4μ g/ml時,其共振散射值降低,出現(xiàn)共振散射的猝滅現(xiàn)象,且隨金顆粒的粒徑增大,膠體金出現(xiàn)猝滅現(xiàn)象的濃度逐漸降低,如50nm的膠體金質(zhì)量濃度大于17.7μ g/ml后,其散射光強度亦猝滅[7],故液相納米微粒體系需要控制金顆粒的粒徑和膠體金濃度。如文所述,在一定的緩沖條件下,金標(biāo)抗會發(fā)生松散的聚集導(dǎo)致金顆粒粒徑增大,對比 10、21、50nm的膠體金體系,50nm 金標(biāo)抗極易聚集為粒徑更大的金顆粒,導(dǎo)致發(fā)生猝滅濃度低于17.7μ g/ml。故在10nm的膠體金體系中選擇了19.3μ g/ml膠體金,其遠(yuǎn)低于 10nm膠體金體系的猝滅濃度,故易獲得較好的線性范圍,這也為該體系工作曲線所證實(表1)。在21,50nm的膠體金體系中選擇了14.5μ g/ml膠體金,也均低于該膠體金的猝滅濃度。再者,在不同粒徑的膠體金體系中加入兔抗hCG獲得金標(biāo)抗,測定不同兔抗?jié)舛认碌奈舛鹊淖兓?確定適宜的標(biāo)記量,10,21nm的金顆粒能在較少量的兔抗溶液中獲得較為穩(wěn)定吸光度值,通過共振散射值證實:粒徑小的金顆粒標(biāo)記效率高,且測定體系的線性關(guān)系良好,用于實際樣品的測定,結(jié)果滿意。50nm膠體金體系標(biāo)記效率相對較低,故體系的線性關(guān)系和檢測限均欠佳。綜上,結(jié)合文獻(xiàn)[8-9]報導(dǎo),采用共振散射光譜法測定液相免疫金體系宜選用小粒徑的膠體金顆粒,粒徑約8～15nm為宜。

[1]陳新建,陳梅英,趙會杰.免疫學(xué)技術(shù)在植物科學(xué)中的應(yīng)用[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1998:347-350.

[2]陳小鋒,劉曙照.膠體金標(biāo)記免疫分析及其在小分子化合物快速檢測中的應(yīng)用[J].藥物生物技術(shù),2004,11(4):278-280.

[3]吳會靈,李文友,何錫文.乙醇敏化鈦黃與蛋白質(zhì)作用的共振光散射光譜研究及其分析應(yīng)用[J].化學(xué)學(xué)報,2002,60(10):1822-1827.

[4]李珊,劉忠芳,劉紹璞.胰蛋白酶與 DNA相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應(yīng)用研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報,2006,27(2):432-437.

[5]朱立平,陳學(xué)清.免疫學(xué)實驗方法[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2000:426-429.

[6]蔣治良,馮忠偉,李廷盛,等.金納米粒子的共振散射技術(shù)[J].中國科學(xué),B輯,2001,31(2):183-188.

[7]潘宏程,蔣治良,袁偉恩,等.金納米粒子共振散射與共振吸收的關(guān)系[J].應(yīng)用化學(xué),2005,22(3):282-285.

[8]Jiang Zhiliang,Zou Mingjing,Liang Aihui.An immunonanogold resonance scattering spectral probe for rapid assay of human chorionic gonadotrophin Clinica Chimica Acta[J],2008,387:24-30.

[9]鄒明靜.免疫球蛋白M和人絨毛膜促性腺激素的金標(biāo)記免疫共振散射光譜分析[D].廣西師范大學(xué),2007,82-95.

[10]彭劍淳,劉曉達(dá),丁曉萍.可見光光譜法評價膠體金粒徑及分布[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2000,24(3):211-211.

Grain-size Selection of Nanogold Particles in Liquid Immunoassay and Its Application

ZOU Ming-jing,WANG Na*
(Heze Medical College,Heze274030,China;*Shangqiu Medical College)

ObjectiveTo explore the effects of nanogold in different sizes on liquid immunoassay system.MethodsThe gold nanoparticles in sizes of 10,21,50nm were prepared to label rabbit hCG antiserum,selecting spectrophotometry and resonance resonance scattering spectrometry to analyse The nanogold-labeled antiscruni and immunonogold-complex..ResultsThe labeling efficiency of nanogold in size of 10nm was better,with good linear range.The nanogold-labeled antiserum was used to assayed hCG in urine samples,it has satisfactory results.ConclusionIt's better to choose the nanogold particles in sizes of 8～15nm in liquid immunoassay by resonance resonance scattering spectrometry.

gold-labeled;Resonance scattering;Human chorionic gonadotrophin

R392-33

A

1008-4118(2010)02-0004-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2010.02.03

2010-03-02