具星愛 郭子寬 靳繼德 李占全

凝血酶活化的富血小板血漿促進人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖

具星愛 郭子寬 靳繼德 李占全

目的探索凝血酶活化的富血小板血漿（Thrombin-activated platelet-rich plasma，tPRP）替代牛血清，進行人骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stme cells，MSC）分離及培養(yǎng)擴增的可行性。方法分別用MTT法和羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯標記細胞技術(shù)，觀察人骨髓MSC在含有tPRP和胎牛血清培養(yǎng)體系中的增殖狀態(tài)；利用流式細胞學技術(shù)檢測細胞表面表型；細胞化學染色法分析不同培養(yǎng)體系所獲細胞的成骨及成脂細胞分化能力。結(jié)果tPRP培養(yǎng)的人骨髓MSC呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)，且tPRP促MSC增殖能力優(yōu)于篩選后的胎牛血清。tPRP培養(yǎng)的MSC均表達CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，而不表達CD31、CD34、CD45和HLA-DR。體外分化實驗顯示，利用tPRP培養(yǎng)的MSC具有體外成骨和成脂能力。結(jié)論tPRP可以替代胎牛血清，用于人骨髓MSC的培養(yǎng)。

凝血酶富血小板血漿骨髓間充質(zhì)干細胞

近年來，基于骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSC）的細胞治療和組織工程，已成為醫(yī)學領(lǐng)域乃至整個生命科學領(lǐng)域中的研究熱點和前沿。但是，國內(nèi)外臨床級別MSC的體外擴增體系，多使用經(jīng)過篩選的胎牛血清。胎牛血清成分不明確，其中可能含有動物攜帶的已知或未知的病原體；將這種體系應(yīng)用于臨床試驗，增加了人畜共患病傳播和異種免疫反應(yīng)的風險。為了優(yōu)化MSC培養(yǎng)體系，我們制備凝血酶活化的富血小板血漿上清（Thrombin-activated platelet-rich plasma，tPRP），用于人骨髓MSC的培養(yǎng)擴增，探討以其替代胎牛血清的可能性。

1 材料與方法

1.1 tPRP的制備

富血小板血漿由全軍采供血中心制備。每1 mL富血小板血漿加入1 U人凝血酶（Sigma公司）活化；1 500 g離心15 min后留取上清，即為tPRP。加入肝素鈉500 U/mL，以避免形成凝膠。分裝凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)

取肝素抗凝的正常人骨髓5 mL，用1 mL注射器過濾后，加入PBS以1∶1比例稀釋骨髓，充分混勻，計數(shù)后調(diào)整有核細胞濃度為1×107cells/mL，按照1∶1比例將骨髓細胞懸液加于Ficoll細胞分離液（1.077 g/mL）液面之上，1 500 r/min離心20 min；吸出單個核細胞層，用PBS稀釋，1 500 r/min離心8 min，收獲單個核細胞。以α-MEM重懸細胞，將培養(yǎng)體系分成3組，分別加入2%tPRP、5%tPRP、10%篩選FCS（Stem Cell Co），計數(shù)后按2×105cells/cm2的密度分瓶培養(yǎng)。72 h后換液，去除未貼壁細胞。以后3 d換1次液。原代培養(yǎng)第4天，可見分裂中的紡錘形的貼壁細胞；第6天，可見明顯細胞克隆形成；第10天，可見細胞呈漩渦狀生長，達80%融合。此時，以0.05%胰蛋白酶消化傳代，按6 000 cells/cm2接種于新培養(yǎng)瓶，記為第1代。第3代細胞用于本實驗研究。重復上述細胞傳代的操作即可實現(xiàn)細胞的有效擴增。

1.3 細胞增殖能力測定

將第3代細胞以1.5×103個/孔接種于平底96孔板內(nèi)，每孔200 μL的不同培養(yǎng)體系，每組3孔。將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)72 h。每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h。之后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定光吸收值，記錄結(jié)果。

1.4 羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）細胞增殖能力檢測

0.05 %胰蛋白酶消化細胞，磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整細胞濃度為1×106cells/mL，加入CFSE 5 μmol/L，37℃避光孵育15 min。4℃磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次，用α-MEM重懸細胞并分別加入2%tPRP、5% tPRP和10%篩選FCS培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后，收集細胞，F(xiàn)ACS Calibur收集數(shù)據(jù)，WinMDI 2.9軟件分析熒光強度。

1.5 細胞表型的流式分析

將第3代處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，以0.05%胰蛋白酶消化并計數(shù)，分別取2×105個細胞與鼠抗人CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166、HLA-ABC和HLA-DR單克隆抗體（Becton-Dickinson公司）避光、室溫反應(yīng)30 min，用冰冷的PBS+1%BSA徹底洗滌細胞2遍，用FCM緩沖液（含1%多聚甲醛+0.1%疊氮化鈉+0.5%BSA的PBS液）固定細胞。FACS Calibur流式細胞儀收集數(shù)據(jù)，WinMDI 2.9軟件分析結(jié)果。

1.6 成骨分化誘導及檢測

將處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，接種于24孔細胞培養(yǎng)板（1.0×104個/孔），非誘導組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導組培養(yǎng)液中加入標準誘導劑（Dex 100 nM+β-GP 10 mM+AsAP 0.05 mM）進行成骨分化誘導，每3天換液，第14天應(yīng)用堿性磷酸酶組化染色試劑盒進行堿性磷酸酶（ALP）染色。

1.7 成脂分化誘導及檢測

將處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，接種于24孔細胞培養(yǎng)板（1.5×104個/孔），非誘導組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導組培養(yǎng)液中加入標準誘導劑（Dex 1 μM+IBMX 0.5 mM+吲哚美辛100 μM）進行成脂分化誘導，每3天換液，第8天進行油紅O染色。

1.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

骨髓分離的單個核細胞，分別用2%tPRP，5% tPRP與10%FCS接種72 h后鏡下觀察，可見散在分布的貼壁的紡錘形細胞，經(jīng)兩次全量換液后可基本去除非貼壁細胞。培養(yǎng)7～10 d，細胞克隆增大，接近80%融合。傳代的MSC形態(tài)均一，呈成纖維細胞樣，排列緊密，生長旺盛，融合密度可達2.0×104cells/cm2（圖1）。

圖1 tPRP培養(yǎng)的人骨髓MSC的典型形態(tài)（100×）（左：72 h；右：1周）

2.2MTT法與CFSE細胞增殖實驗評價

將2%tPRP、5%tPRP與10%FCS體系培養(yǎng)的MSC，以MTT法比較72 h的細胞增殖狀況。發(fā)現(xiàn)tPRP對MSC的促增殖作用優(yōu)于10%FCS（P＜0.05），而2%tPRP與5%tPRP之間無差異（P＞0.05）。利用CFSE細胞標記技術(shù)，實驗結(jié)果表明，tPRP促MSC增殖效果優(yōu)于10%FCS（圖2）。

圖2 不同體系培養(yǎng)的MSC的增殖能力比較

2.3 MSC細胞表型的流式分析

收獲第5代不同體系培養(yǎng)的MSC，流式細胞儀分析細胞免疫表型，發(fā)現(xiàn)細胞均一表達CD29、CD73、CD105和CD166，陽性率均在95%以上；不表達內(nèi)皮細胞標志CD31及造血細胞標志CD34和CD45；表達HLA-ABC，但不表達HLA-DR。該結(jié)果表明，所培養(yǎng)細胞無造血細胞、內(nèi)皮細胞的混雜，具有典型的間充質(zhì)干細胞表型特征（圖3）。

圖3 tPRP培養(yǎng)的人MSC表型特點（縱坐標：細胞數(shù)；橫坐標：相對熒光強度）

2.4 成骨與成脂定向誘導分化與鑒定

成骨分化定向誘導培養(yǎng)后1周，部分細胞基質(zhì)出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣鈣沉積。培養(yǎng)2周之后，按堿性磷酸酶檢測試劑盒操作步驟進行堿性磷酸酶染色。染色后，堿性磷酸酶在胞漿內(nèi)顯示為藍色顆粒狀物，對照組細胞未加誘導劑，堿性磷酸酶染色呈陰性。成脂分化定向誘導培養(yǎng)后1周時，少數(shù)細胞內(nèi)就出現(xiàn)微小明亮的脂滴。隨著誘導時間的延長，出現(xiàn)脂滴的細胞增多，細胞由梭形變成橢圓形或角形。培養(yǎng)2周后，脂滴數(shù)目增多、融合。油紅O染色后鏡下觀察，細胞內(nèi)脂滴呈明亮橙紅色,非誘導組呈陰性（圖4）。

圖4 tPRP培養(yǎng)的MSC體外分化能力分析

3 討論

MSC在細胞替代治療和基因治療中具有重要的臨床應(yīng)用價值。將體外擴增的MSC移植至組織損傷部位后，通過兩種功能發(fā)揮促進組織再生作用：①在局部微環(huán)境作用下，可定向分化為某一特定類型功能細胞，直接參與組織損傷修復過程；②可分泌多種生物活性物質(zhì)，包括細胞因子和細胞生長因子等，以改善組織損傷部位的再生微環(huán)境。這些作用具體表現(xiàn)為：①趨化周圍的宿主干/祖細胞遷徙至損傷部位；②促進干祖細胞的增殖分化；③抑制受損傷細胞的凋亡；④促進毛細血管發(fā)芽，加速血管新生；⑤激活周圍細胞金屬硫蛋白酶活性，抑制瘢痕形成；⑥調(diào)節(jié)免疫細胞功能，抑制炎性反應(yīng)[1－5]。然而，由于直接從體內(nèi)獲取的MSC數(shù)量很少，無法滿足臨床治療要求，需要在較短時間內(nèi)擴增至足量的細胞數(shù)目。因此，對于MSC培養(yǎng)支持物，除了要獲得符合標準的細胞，還需要良好的擴增效率，這是至關(guān)重要的[6]。

富血小板血漿含有多種生長因子，包括血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)移生長因子-β1和β2（TGF-β1、β2）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子，白介素-1（IL-1）、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子和血小板激活因子等[7]。但是，血小板作用的發(fā)揮有賴于其濃縮血小板被激活后α顆粒釋放各類生長因子及纖維蛋白原所形成的纖維網(wǎng)狀支架。人的凝血酶Thrombin，可以模仿生理狀態(tài)下激活，使α顆粒釋放出高濃度的生長因子，以及形成血小板微粒，促進細胞有絲分裂[8-10]。富血小板血漿中含有血小板膜等聚合物，可能抑制MSC的黏附及擴增；而且，與血小板膜聯(lián)合的血小板抗原可引起免疫反應(yīng)[11]。因此，我們制備tPRP時，以離心方法來除去膜成分，以避免上述問題，提高其實用性。

用富血小板血漿上清擴增的MSC，保留了固有的體外成骨和成脂肪能力，可用于組織工程的臨床和實驗研究。

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Thrombin-Activated Platelet-Rich Plasma Promotes the Proliferation of Human Marrow Mesenchymal Stem Cells

JU Xingai1,GUO ZiKuan2,JIN Jide2,LI Zhanquan1.1 Shengjing Hospital of China Medical University,Shengyang 110016, China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850.Corresponding author:LI Zhanquan.

ObjectiveTo investigate whether the supernatants of thrombin-activated platelet-rich plasma could be used as a substitute for the isolation and culture-expansion of human mesenchymal stem cells.MethodsHuman marrow mesenchymal stem cells(MSC)were cultured in media containing the supernatants of thrombin-activated platelet-rich plasma (tPRP)and fecal calf sera(FCS)selected from lots.Their proliferation status was evaluated by MTT and carboxyfluorescence diacetatesuccinimidyl ester-labeling assays.Furthermore,the phenotypic characteristics were analyzed by flow cytometry and the differentiations along adipogenic and osteogenic pathways were assessed by histological staining.ResultsMSC cultured in medium containing tPRP displayed a typical fibroblast-like morphology and,compared with(FCS),tPRP exhibited more potent activities to support the expansion of MSC.Flow cytometry showed that they were homogenously positive for CD29, CD73,CD166 and HLA-ABC and negative for CD31,CD34,CD45 and HLA-DR.Differentiation assays showed that of MSC cultured with tPRP occupied the capacities of in vitro osteogenesis and adipogenesis.ConclusionIt is concluded that human tPRP might be an optional substitute to FCS for MSC proliferation.

Thrombin;Platelet-rich plasma;Mesenchymal stem cells

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）01－0014－04

2009年10月26日；

2010年1月9日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.004

科技重大專項項目（2009zx09503-019），國家高技術(shù)發(fā)展項目（863項目）（2007AA02z454），國家自然科學基金項目（30873018和30971068）。

110016遼寧省沈陽市中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院（具星愛，李占全）；100850北京市軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所實驗血液學研究室（郭子寬，靳繼德）。

李占全。