聶芳菲 潘柏林 李健寧

軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)和纖維蛋白凝膠支架皮下構(gòu)建組織工程軟骨

聶芳菲 潘柏林 李健寧

目的觀察皮下植入異體軟骨細(xì)胞復(fù)合異種軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)（Cartilage microparticle acellular matrix，CMACM）和纖維蛋白膠（Fibrin glue，F(xiàn)G）為支架形成組織工程軟骨的可能性。方法制備豬耳廓CMACM，體外培養(yǎng)成年兔的耳軟骨細(xì)胞，將不同的混合物植入5只成年兔背部皮下。A組：異體軟骨細(xì)胞復(fù)合CMACM和FG；B組：自體軟骨細(xì)胞復(fù)合CMACM和FG；C組：CMACM和FG。將每只兔子背部皮膚均分為6個(gè)區(qū)，分別植入不同混合物各兩個(gè)點(diǎn)，以備兩次取材。觀察并記錄皮下植入體的形態(tài)變化，分別于植入后8周和12周取材，行組織學(xué)檢測。結(jié)果A組和C組未能形成軟骨樣組織。B組8周可以形成軟骨樣組織，周圍炎癥細(xì)胞數(shù)量較多；12周時(shí)形成的軟骨組織成分單一，周圍沒有炎癥反應(yīng)，類似于正常軟骨，且新生的軟骨組織中均長有許多小血管，新生軟骨的厚度不超過1 mm。結(jié)論將同種異體軟骨細(xì)胞復(fù)合CMACM和FG植入皮下，不能形成軟骨樣組織；而以自體軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞則可以得到軟骨樣組織，但新生軟骨的體積和厚度有限，并且新生的軟骨組織中長有許多小血管，可能更有利于新生軟骨組織的長期存活。

異體軟骨細(xì)胞軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)組織工程

脫細(xì)胞基質(zhì)（Acellular matrix，ACM）是指異體組織經(jīng)過細(xì)胞滅活處理后，制備成無活體細(xì)胞存在的ECM成分和結(jié)構(gòu)。因其無抗原性且具備良好的生物相容性，使之成為組織工程支架材料的選擇之一。軟骨微粒脫細(xì)胞基質(zhì)（Cartilage microparticle acellular matrix，CMACM）是一種新型的支架材料，與普通的軟骨ACM相比，其總表面積大大增加，且微粒表面粗糙，有效提高了細(xì)胞的黏附率，解決了細(xì)胞只能在ACM表面生長的局限性。實(shí)驗(yàn)研究表明，將自體軟骨細(xì)胞與異體CMACM和纖維蛋白凝膠（Fibrin glue，F(xiàn)G）結(jié)合，回植于小型豬皮下，8周后培養(yǎng)出的組織工程化軟骨組織細(xì)胞生長良好，具有分泌軟骨基質(zhì)的功能[1]。由于皮下移植在耳廓重建及鼻整容手術(shù)中的應(yīng)用價(jià)值，本研究擬進(jìn)一步觀察了兔皮下植入異體軟骨細(xì)胞復(fù)合豬CMACM和FG形成軟骨組織的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑和儀器

純品系新西蘭大白兔5只，體重2.5～3 kg，成年，雌雄不限（北京大學(xué)第三醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心）。氯化鉀分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；1∶250胰蛋白酶（Amresco公司，美國）；乙二胺四乙酸（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；Ⅱ型膠原酶（Invitrogen公司，美國）；DMEM/F12聯(lián)合培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hyclone公司，美國）；天繡醫(yī)用生物蛋白膠（廣州倍繡生物技術(shù)有限公司）。組織粉碎機(jī)（珠海北美電器有限公司）；冷凍干燥機(jī)（Yamato，日本）；CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 制備CMACM

以豬耳廓軟骨為原料，按照文獻(xiàn)[1]方法制備。

1.3 體外培養(yǎng)兔耳軟骨細(xì)胞

在無菌條件下切取實(shí)驗(yàn)兔一側(cè)耳軟骨，生理鹽水沖洗干凈，將軟骨組織剪碎成懸液狀；1 000 r/min離心5 min，吸除多余的液體，加入2～3倍體積的0.3%Ⅱ型膠原酶溶液；37℃恒溫振蕩器中振蕩3 h。1 000 r/min離心5 min，吸除上層消化液，用PBS吹打稀釋，150目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約7～10 d后按1∶4的比例傳代；傳代后生長迅速，約2～3 d后按1∶4的比例再次傳代；約2～3 d后細(xì)胞再次長滿瓶底，收集第2代軟骨細(xì)胞用于回植。

1.4 軟骨細(xì)胞復(fù)合CMACM和FG混合物的制備

皮下植入前24 h，預(yù)先將適量的CMACM用含20%胎牛血清的DMEM/F12（每100 mg CMACM用5 mL培養(yǎng)基）37℃浸泡24 h。1 000 r/min離心5 min，分別獲取每個(gè)植入點(diǎn)所需的細(xì)胞和CMACM沉淀；將新鮮配制的0.5 mL纖維蛋白原和0.5 mL凝血酶分別加入準(zhǔn)備好的細(xì)胞沉淀和CMACM沉淀中，分別混勻。

混合物分類：A組，異體軟骨細(xì)胞復(fù)合CMACM和FG；B組，自體軟骨細(xì)胞復(fù)合CMACM和FG；C組，CMACM和FG。每份A或B混合物約含5×107個(gè)細(xì)胞、50 mg CMACM和1 mL FG；每份C混合物約含50 mg CMACM和1 mL FG。

1.5 皮下植入及植入后觀察

將每只兔子背部皮膚劃分為6個(gè)區(qū)，分別植入A、B、C組混合物各兩個(gè)點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，密切觀察實(shí)驗(yàn)兔的一般情況和皮膚局部反應(yīng)，觀察并記錄皮下植入體的形態(tài)、大小、軟硬度等變化。

1.6 組織學(xué)檢測

(2)對于北部灣經(jīng)濟(jì)區(qū)資本一體化的測度，下面將從北部灣經(jīng)濟(jì)區(qū)區(qū)內(nèi)資本總流量來反映區(qū)內(nèi)金融一體化的發(fā)展水平。區(qū)內(nèi)資本總流量使用公式fil=(OFCt+IFCt)/GDPt來計(jì)算，通過對北部灣經(jīng)濟(jì)區(qū)歷年數(shù)據(jù)的查閱(本文主要選取2008年—2011年全區(qū)GDP和進(jìn)出口總額)，經(jīng)過計(jì)算得到結(jié)果如下：

分別于植入后8周和12周取材，行組織病理學(xué)染色，HE染色顯示基本的組織結(jié)構(gòu)；Mallory染色顯示組織中所含結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)（膠原纖維被染成藍(lán)色）；醛品紅染色觀察被染成紫色的彈性纖維；甲苯胺藍(lán)和阿爾新蘭染色顯示軟骨基質(zhì)中的黏多糖成分（糖胺多糖），陽性結(jié)果為軟骨基質(zhì)呈紫色（甲苯胺藍(lán)染色）和藍(lán)色（阿爾新蘭染色）。

2 結(jié)果

2.1 CMACM的性狀與檢測

CMACM呈白色粉末狀，質(zhì)地較均勻，使用前以完全培養(yǎng)基浸泡成懸液狀。HE染色顯示CMACM紅染，微粒邊緣粗糙，膠原纖維交錯排列，未見軟骨細(xì)胞（圖1）。

2.2 軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增

原代細(xì)胞為小圓形，傳代后生長迅速。第2代細(xì)胞呈圓形、多角形或梭形，有細(xì)胞群集現(xiàn)象，仍可見到同源細(xì)胞群（圖2）。

2.3 植入物的體內(nèi)觀察

植入皮下的混合物即刻觀察直徑為2.3 cm，厚約3 mm，質(zhì)軟。A、B兩組植入后24 h，觸之可隨皮膚移動，質(zhì)軟；1周左右變硬，具有彈性和韌性，在皮下移動性好；4周時(shí)體積明顯縮小，直徑約1 cm；8周時(shí)直徑約0.5 cm；12周時(shí)呈扁平，幾乎觸摸不到。C組植入后質(zhì)軟，皮下物邊界不清，2周左右稍硬，直徑約1 cm，4周時(shí)幾乎觸摸不到。

圖1 CMACM（HE，100×）

圖2 第2代軟骨細(xì)胞（100×）

圖3 A組植入前（HE，100×）

圖4 A組植入后8周（HE，100×）

圖5 C組植入后8周（HE，100×）

圖6 A組植入后12周（HE，100×）

圖7 B組植入后12周（HE，40×）

圖8 B組植入后12周（HE，100×）

圖9 B組植入后12周（Mallory，40×）

植入前，HE染色示FG無色，基質(zhì)粉染，細(xì)胞核呈藍(lán)色，證實(shí)為混勻的軟骨細(xì)胞、CMACM和FG（圖3）。

8周時(shí)，A組HE染色顯示軟骨細(xì)胞較少，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞（圖4），醛品紅、甲苯胺藍(lán)和阿爾新蘭的軟骨組織染色陰性；B組軟骨細(xì)胞活力旺盛，細(xì)胞嗜堿性強(qiáng)，形成的類軟骨樣組織中有血管長入，其旁可見炎性細(xì)胞及未被完全吸收的CMACM，醛品紅、甲苯胺藍(lán)和阿爾新蘭染色均陽性；C組HE染色示蛋白膠內(nèi)無任何細(xì)胞，分布在蛋白膠內(nèi)的CMACM周圍有炎性細(xì)胞浸潤（圖5）。

12周時(shí)，A組中CMACM和細(xì)胞均處于被吸收狀態(tài)（圖6），醛品紅、甲苯胺藍(lán)和阿爾新蘭染色陰性；B組軟骨細(xì)胞活力旺盛，細(xì)胞嗜堿性強(qiáng)，形成的類軟骨樣組織中有血管長入，其旁未見炎性組織，植入的CMACM已被完全吸收。軟骨組織厚度不超過1 mm，醛品紅、甲苯胺藍(lán)和阿爾新蘭染色均呈陽性（圖7～12）；C組已被完全吸收，未找到植入的組織。

圖10 B組植入后12周（醛品紅，40×）

圖11 B組植入后12周（甲苯胺蘭，40×）

圖12 B組植入后12周（阿爾新蘭，40×）

3 討論

目前軟骨細(xì)胞復(fù)合ACM的研究多聚焦于自體軟骨細(xì)胞復(fù)合同種異體的ACM上，已經(jīng)報(bào)道的結(jié)果均較滿意。但是，尚未見到異體軟骨細(xì)胞復(fù)合ACM或自體軟骨細(xì)胞復(fù)合異種ACM的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)合植入自體軟骨細(xì)胞、異種CMACM和FG，皮下可以形成軟骨樣組織；而異體軟骨細(xì)胞復(fù)合異種CMACM和FG的皮下植入，則未能形成軟骨樣組織。其可能的原因有：①移植細(xì)胞的異體排斥，對于其機(jī)制目前有多種解釋[2]，而通過多種方法，可建立同種異體軟骨細(xì)胞的免疫耐受[3－5]。②局部微環(huán)境因素影響，已有學(xué)者報(bào)道異體細(xì)胞復(fù)合某種支架可以修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損[6－7]。③可能與材料的性質(zhì)及軟骨細(xì)胞供體的年齡有關(guān)。李景紅等[8]將1月齡兔耳廓軟骨細(xì)胞種于PDLLA上形成復(fù)合物，6 h后植于兔皮下，18周時(shí)可以形成基本接近正常軟骨的新生軟骨。呂威等[9]將出生3～5 d的新西蘭大白兔四肢關(guān)節(jié)軟骨組織酶解，分離出軟骨細(xì)胞，體外擴(kuò)增后接種到PLA三維可吸收支架上；再將軟骨細(xì)胞-PLA復(fù)合物移植到成年新西蘭大白兔的背部皮下，經(jīng)過7周的體內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞-PLA復(fù)合物在同種異體的動物體內(nèi)形成新生軟骨組織，且隨著植入時(shí)間的延長，軟骨基質(zhì)的分泌增加，炎性細(xì)胞的浸潤逐漸減輕。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，即使是自體耳軟骨細(xì)胞所形成的植入物，植入后體積也明顯縮小，且新生的軟骨組織厚度不超過1 mm，其中還長入許多小血管，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，即當(dāng)組織工程材料的厚度超過1 mm時(shí)，其內(nèi)部的細(xì)胞將很難通過滲透作用獲得營養(yǎng)，必須有毛細(xì)血管長入才能維持正常代謝[10]。

總之，豬源CMACM不能抵抗成年兔對異體軟骨細(xì)胞的排斥反應(yīng)，但是可以與自體軟骨細(xì)胞和FG在皮下共同構(gòu)建一定厚度的組織工程軟骨。

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Preliminary Study on Subcutaneous Tissue-engineered Cartilage with Cartilage Microparticle Acellular Matrix and Fibrin Glue as Scaffold

NIE Fangfei,PAN Bailin,LI Jianning.Department of Plastic Surgery,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China.Corresponding author:LI Jianning.

ObjectiveTo evaluate the possibility of formation of subcutaneously implanted tissue-engineered cartilage using allograft chondrocytes mixed with xenogenic cartilage microparticle acellular matrix(CMACM)and fibrin glue（FG）as scaffold.MethodsChondrocytes were isolated from ears of adult New Zealand white rabbits.CMACM from porcine auricle was established and combined with FG and exoteric amplified chondrocytes.The compound was transplanted into the back of rabbits subcutaneously.The experiment was divided into three groups according to compound components。Group A,allograft chondrocytes mixed with CMACM and FG;Group B,autograft chondrocytes mixed with CMACM and FG;Group C with CMACM and FG.Five adult rabbits were used，and six regions were divided on the back of every rabbit.Each rabbit was injected compound of group A,B and C in two regions.Specimens were evaluated macroscopically,then harvested and detected histologically at 8 and 12 weeks after operation.ResultsIn group A and C compounds could not form subcutaneous cartilage tissues.While cartilage tissues formed with group B mixtures at 8 weeks;At 12 weeks,new-formed cartilage tissues seemed even more stabilized without inflammatory around it.The size of new-formed cartilage was obviously shrinked with small vessels growing into it and the thickness of new-formed cartilages was only 1 mm.ConclusionThe autogenic chondrocytes combining CMACM and FG matrix is a potential material to the cartilage tissue engineering.The volume and thickness of new-formed cartilage tissue is limited and micro-vessles growing into cartilage may contribute to longer survival for new tissues.

Allograft chondrocyte;Cartilage microparticle;Acellular matrix;Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2010）01－0005－04

2010年1月4日；

2010年2月10日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.002

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30672186）。

100191北京市北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科。

李健寧。