王迎春 劉炎芳 朱瑞萍

隨著人們生活方式及飲食習慣的改變，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為最常見的慢性肝病，其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)可進展為肝硬化及肝功能衰竭，目前缺乏有效的治療手段［1］。體內(nèi)外實驗證明，丹酚酸B具有清除氧自由基及抗肝纖維化作用［2］，對NASH可能有治療作用。為此，本研究通過高脂飲食復制大鼠NASH模型，探討丹酚酸B對實驗性大鼠NASH的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性SD大鼠36只，體重150 g左右，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心。大鼠正常飲食喂養(yǎng)1周后，隨機分為3組(n=12)，即對照組、NASH模型組及丹酚酸B治療組。對照組給予普通飼料，其余各組均給予高脂飼料(88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇)喂養(yǎng)。實驗動物自由飲水和進食，分籠飼養(yǎng)于(20±2)℃明暗各12 h動物室內(nèi)。于12周處死模型組。治療組每天以濃度為1 mg/ml的丹酚酸B溶液20 ml/kg灌胃，同時繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，對照組以20 ml/kg蒸餾水灌胃，同時繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)。于實驗第24周處死剩余實驗動物，隔夜禁食，次日以2%戊巴比妥鈉溶液按1.5 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，下腔靜脈采血后處死，迅速取出肝臟，按常規(guī)制備血清和肝組織石蠟切片，在肝右葉固定部位切取肝組織液氮保存待測。稱體重、肝臟濕重，并計算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100%)。

1.2 主要試劑及藥品 鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫染色超敏試劑盒、鼠抗TIMP-1單克隆抗體均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司，按試劑盒說明書進行操作。丹酚酸B購自四川本草植物化工有限公司。

1.3 血清生化指標測定 血清TG、TC、ALT、AST測定，按試劑盒規(guī)范操作，全自動生化分析儀檢測。

1.4 肝臟生化指標測定 在相同部位精確稱取肝臟1.0 g，加入預冷的生理鹽水，在冰水中制成10%的均漿，4℃3000 r/min離心15 min，提取上清液，用硫代巴比妥酸法測定MDA的含量(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)，所有操作均按產(chǎn)品說明書進行。

1.5 組織病理學檢測 福爾馬林固定肝標本，石蠟切片進行HE染色，在光鏡下觀察肝脂肪變性和炎癥活動情況。肝細胞脂肪變性判斷標準:肝小葉未見脂滴肝細胞為陰性，脂滴肝細胞占肝細胞總數(shù)小于1/3為(+)，1/3～2/3為(++)，大于2/3為(+++)，幾乎均呈脂滴肝細胞為(++++)。炎癥活動度計分標準參考Knodell提出的慢性肝炎組織學活動指數(shù)(HAI)進行計分，分為匯管區(qū)炎癥(P)，小葉內(nèi)炎癥(L)，碎屑壞死(PN)及橋狀壞死(BN，包括多小葉壞死)四項，每項依此計分為1、2、3、4分，因為BN、PN的嚴重程度與預后直接相關，故計分2倍于其他病變，計分公式為P+L+2(PN+BN)。

1.6 免疫組織化學檢測肝組織TIMP-1的表達 采用SP法作免疫組織化學染色，切片常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復、脫水、透明、樹膠封片。采用KL型免疫圖象處理系統(tǒng)進行半定量指標判斷:未見陽性細胞為(-)，陽性細胞占肝小葉全部肝細胞的1/3以下為(+)，1/3～2/3為(++)，2/3以上為(+++)。為保證實驗結果的可靠性，特別是免疫組織化學的特異性，本實驗采用省略一抗和二抗，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.7 RT-PCR法檢測肝組織TGF-β1mRNA的表達 采用美國GIBCO公司生產(chǎn)的一步法。

總RNA提取試劑盒，TRIZOL試劑按說明書操作提取總RNA，PCR 反應體系內(nèi)含 cDNA 2 μl、10хbuffer 5 μl、4хdNTP(2 mmol)2μl、TGF-β1、GAPDH 引物各 2 μl，Taq 酶 1U，超重水補至20μl。TGF-β1 上游引物 5’CTT CAG CTC CAC AGA GAA CTG C 3’，下游引物 5’CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C 3’，GAPDH上游引物5’CCC TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATG G 3’，下游引物 5’CAT GGT GGT GAA GAC GCC AG 3’。各取1μg總RNA抽取物加入此反應體系進行PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為:97℃ 2 min、94℃ 30sec、56℃30sec、72℃50sec，50次循環(huán)。取PCR擴增產(chǎn)物10μl加入2%瓊脂糖凝膠中在TAE緩沖液50V 1 h電泳，溴化乙錠顯色成像定量分析，結果經(jīng)計算機圖像灰度掃描數(shù)字轉換后進行統(tǒng)計學處理，以目的基因條帶光密度值與內(nèi)對照GAPDH條帶光密度值的比表示目的基因相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用方差分析，等級資料采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 生化指標的檢測:與對照組相比，模型組血清 ALT、AST、TG、TC及肝組織MDA等顯著增高，治療組較模型組顯著下降。見表1。

表1 各組大鼠生化指標的檢測結果()

表1 各組大鼠生化指標的檢測結果()

注:a模型組與對照組比較，P值均＜0.01;b治療組與模型組比較P值均＜0.01

組別 n ALT(U/L) AST(U/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) MDA(nmol/mg蛋白)對照組 12 42.50±5.58 112.43±16.72 0.82±0.32 1.32±0.27 2.36±0.24模型組 12 72.48±8.32a 215.53±29.83a 1.36±0.44a 2.15±0.42a 4.82±0.57a治療組 12 39.16±8.25b 102.26±18.41b 0.73±0.53b 1.16±0.54b 2.68±0.87b

2.2 肝臟指數(shù)及病理學變化:與對照組相比，模型組肝臟指數(shù)明顯升高;高脂飲食引起大鼠肝臟明顯的脂肪變性，模型組脂肪變性明顯，炎癥活動度計分顯著高于對照組。丹酚酸B治療組炎癥活動度計分顯著低于模型組。見表2。

表2 各組大鼠肝臟指數(shù)及病理學變化()

表2 各組大鼠肝臟指數(shù)及病理學變化()

注:模型組與對照組比較，a P值＜0.05，aa P值＜0.01;治療組與模型組比較，b P值＜0.05，bb P值＜0.01

炎癥活動度計分對照組組別 n 肝臟指數(shù) 肝細胞脂肪變性程度- + ++ +++ ++++12 0.026±0.001 12 0 0 0 0 0模型組 12 0.036±0.001a 0 0 0 0 12 5.23±0.87aa治療組 12 0.030±0.001b 0 3 2 5 2 1.84±0.52bb

2.3 TIMP-1及TGF-β1mRNA的表達:TIMP-1檢測陽性信號呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀，分布在肝細胞漿內(nèi)，未見細胞核著色。與對照組相比，模型組TIMP-1表達明顯升高;與對照組相比，模型組TGF-β1mRNA的表達顯著升高，丹酚酸B治療組TGF-β1mRNA的表達顯著低于模型組。見表3。

表3 各組大鼠肝組織中TIMP-1及TGF-β1mRNA的表達()

表3 各組大鼠肝組織中TIMP-1及TGF-β1mRNA的表達()

注:模型組與對照組比較，a P值均＜0.01;治療組與模型組比較，b P值＜0.05，bb P值＜0.01

1mRNA對照組組別 n TIMP-1-+++ +++ TGF-β 12 12 0 0 0 0.56±0.09模型組 12 0 6 4 2a 0.85±0.10治療組 12 5 6 1 0b 0.62±0.05bb

3 討論

NASH是以肝細胞脂肪變性、氣球樣變、彌漫性肝小葉炎癥、肝細胞壞死、肝中央靜脈及肝竇周圍膠原沉積為特征的慢性肝臟疾病，二次打擊理論目前是NASH的主要發(fā)病機制，其發(fā)生與胰島素抵抗(IR)密切相關［3］。首次打擊由IR和脂肪酸代謝紊亂引起脂肪肝;二次打擊在IR的基礎上，由氧應激、脂質過氧化、線粒體功能不全、細胞因子等引起肝細胞炎癥、凋亡、壞死并促發(fā)纖維化進程，導致NASH及NASH相關肝硬化的發(fā)生。IR與一次打擊造成的肝內(nèi)脂質蓄積相互作用，形成脂質代謝的惡性循環(huán)，機體通過線粒體呼吸鏈、微粒體細胞色素P450(CYP)、過氧化物酶體等途徑產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)。當肝內(nèi)產(chǎn)生的ROS超過抗氧化系統(tǒng)清除能力時便產(chǎn)生氧化應激，而脂肪肝時肝內(nèi)蓄積的脂肪為氧化應激提供了足夠的反應基質。脂肪酸氧化產(chǎn)生肝毒性的ROS，從而加速氧化應激過程，推動了脂肪肝向肝炎及肝纖維化發(fā)展的進程。其通過三個主要的機制［4，5］:脂質過氧化、細胞因子的誘導以及Fas配體的誘導作用。ROS激活的血漿或線粒體膜脂質過氧化導致細胞壞死或誘導細胞凋亡。脂質過氧化同樣激活丙二醛(MDA)的釋放，后者一方面能與肝細胞蛋白結合，形成抗原，激活有害的免疫反應，本研究證實NASH模型組肝組織MDA的含量明顯增高;另一方面與線粒體的膜脂、膜蛋白交聯(lián)，使膜的流動性降低，影響膜中酶的活性，干擾了脂肪酸的β氧化，加重脂肪在肝內(nèi)蓄積，形成惡性循環(huán)。ROS同樣增加肝細胞中Fas配體的表達，通過Fas配體與相鄰肝細胞上正常表達的Fas受體相作用，誘導細胞凋亡。ROS還激活轉錄因子NF-κB活性，從而增加炎性細胞因子TNF-a、TGF-β1、IL-6等的產(chǎn)生，TGF-β1為致肝纖維化最重要的細胞因子之一，通過與HSC等細胞膜上的TGF-β受體結合，經(jīng)細胞內(nèi)信號傳導中介分子smads蛋白的傳導，將肝臟炎癥損傷等信息傳遞給細胞核，啟動基因轉錄，從而啟動肝臟對炎癥損傷等的修復機制，大量合成細胞外基質(ECM)。基質金屬蛋白酶(MMPs)可以降解多種細胞外基質成分，其活性受基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的調(diào)節(jié)，TIMP1在肝纖維化的形成過程中起著重要的作用，本研究表明TIMP-1及TGF-β1mRNA的表達在NASH模型組明顯增高。

丹酚酸B為丹參干燥根及根莖中提取的有效成分，是丹參水溶性成分中最重要的活性物質，具有很強的抗氧化作用。本研究表明丹酚酸B治療組炎癥活動度計分、MDA含量及TIMP-1和TGF-β1mRNA的表達均顯著低于NASH組，提示丹酚酸B具有抑制脂質過氧化反應及抗肝纖維化作用，其機制可能為丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂質過氧化反應，減少MDA的產(chǎn)生，從而減少肝細胞的損傷，抑制TGF-β1的產(chǎn)生和HSC的增殖活化，具有抗肝纖維化作用。NASH目前缺乏有效的治療方法［6］，因此，丹酚酸B作為治療NASH有效藥物之一，有待于進一步研究。

［1］中華醫(yī)學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪性肝病診療指南.中華肝臟病雜志，2010，18(3):163-166.

［2］劉成海，劉平，胡義楊，等.丹酚酸B鹽對轉化生長因子-β1刺激肝星狀細胞活化與胞內(nèi)信號轉導的作用.中華醫(yī)學雜志，2002，82(18):1267-1272.

［3］Ramesh S，Sanyal AJ.Evaluation and management of nonalcoholic steatohepatitis.J Hepatol，2005，42(1):2-12.

［4］Albano E，Mottaran E，Vidali M，et al.Immune response towards lipid peroxidation products as a predictor of progression of nonalcoholic fatty liver disease to advanced fibrosis.Gut，2005，54(7):987-993.

［5］Diehl AM，Li ZP，Li HZ，et al.Cytokines and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis.Cut，2005，54(2):303-306.

［6］Torres DM，Harrison SA.Diagnosis and therapy of nonalcoholic steatohepatitis.Gastroenterology，2008，134:1682-1698.