康立源，周志煥，張 萌，柴麗娟，高秀梅，王 怡，郭 紅，閆 晨

B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)蛋白（Bax）同屬于Bcl-2家族，但卻具有相反的作用，前者可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，后者能夠促進(jìn)凋亡的發(fā)生。Bcl-2與Bax結(jié)合形成異源二聚體，不顯示各自活性；當(dāng)Bcl-2磷酸化，Bax表達(dá)增多或是B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)凋亡（Bad）取代Bax與Bcl-2結(jié)合后，Bax隨即獲釋而形成誘導(dǎo)死亡的同源二聚體，進(jìn)入線粒體破壞其膜的通透性，將細(xì)胞色素C和凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）釋放至胞漿[1-2]。在三磷酸腺苷（ATP）存在的情況下，細(xì)胞色素C能與Apaf-1形成復(fù)合體，該復(fù)合體可以活化天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9），再激活caspase-3，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過特異性地裂解其底物而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA表達(dá)的變化，采用福林-酚法（Lowrry）法檢測(cè)caspase-3蛋白含量的變化，探討PNS抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕17~18 d Wistar大鼠由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、B-27（GIBCO，美國）；胰酶 1∶250（Ameresco，美國），胎牛血清（HYCLONE，美國）；多聚賴氨酸、EDTA（SIGMA，美國）；Mouse Anti-MAP2單克隆抗體（CHEMICON，美國）、青霉素、鏈霉素（市售分析純）。TRIzol（invitrogenTM，美國），丙三醇、氯仿、無水乙醇（分析純，天津市化學(xué)試劑廠），DEPC、Folin—酚（鼎國，北京），合成的上、下游引物（上海生工生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器 Allegra-64R Centrifuge低溫高速離心機(jī)（BECKMAN，美國），DU-530紫外分光光度計(jì)（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美國），ECP3000水平電泳儀（北京六一儀器廠），GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)（Bio Imaging System，SYNGENE，英國），PCR儀ABI誖7300實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國），Biofuge低溫離心機(jī)（德國），紫外分光光度計(jì)（Backman，美國），熒光分光光度計(jì)（島津，日本）。

2 方法

2.1 神經(jīng)元細(xì)胞（CNC）缺氧復(fù)氧損傷模型的復(fù)制及分組 參照文獻(xiàn)[3-5]，利用三氣培養(yǎng)箱，在94%氮?dú)猓∟2）-5%二氧化碳（CO2）-1%氧氣（O2）孵箱內(nèi)缺氧24 h，95%空氣-5%CO2孵箱中復(fù)氧24 h，復(fù)制CNC缺氧復(fù)氧（H/R）損傷模型。分組及各組處理方案如下：1）Control：置換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，不做缺氧復(fù)氧處理。2）H/R組：置換無血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入94%N2-5%CO2-1%O2條件下的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育24 h，再于95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧孵育24 h。3）H/R+PNS 50 mg/L組：置換含PNS 50 mg/L無血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入94%N2-5%CO2-1%O2條件下的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育24 h，再于95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧孵育24 h。4）H/R+PNS 10 mg/L組：置換含PNS 10 mg/L無血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入94%N2-5%CO2-1%O2條件下的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育24 h，再于95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧孵育24 h。5）H/R+PNS 2 mg/L組：置換含PNS 2 mg/L無血清培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入94%N2-5%CO2-1%O2空氣條件下的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育24h，再于95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧孵育24h。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)缺氧復(fù)氧神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

2.2.1 總RNA的提取與檢測(cè) 六孔板棄培養(yǎng)液，冷PBS洗2次，每孔加500 μL裂解液TRIzol，反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移至1.5 mLEppedorf管中。將樣品在室溫放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加0.1 mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置15~30 min。4℃12 000 r/min離心15 min，樣品分成3層：紅色的有機(jī)相，中間層和無色的水相。把水相轉(zhuǎn)移到新的無RNase的離心管中。緩慢加入1倍體積-20℃保存的丙三醇，混勻，置-20℃2 h以上，充分沉淀RNA。4℃10 000×g離心10 min，棄上清。沉淀加入75%乙醇 1 mL，重新懸浮，4℃ 8 000×γ離心10 min，棄上清液。超凈臺(tái)內(nèi)，室溫?fù)]發(fā)5 min，加入適量無RNnase水輕輕吹打沉淀，使之溶解，分裝備用。紫外分光光度法檢測(cè)RNA樣品的濃度及純度，1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

2.2.2 引物序列的設(shè)計(jì)與合成 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，檢測(cè)基因的引物序列如下：Bcl-2：Forward primer：TCTGTGGATGACTGAGT ACCTGAAC；Reverse primer：AGAGACAGCCAGGAG AAATCAAAC。Bax：Forward primer：GGGTGGTTGCC CTTTTCTACT；Reverse primer：CCCGGAGGAAGTCC AGTGTC。caspase-3：Forward primer：AATTCAAGGG ACGGGTCATG；Reverse primer：GCTTGTGCGCGTAC AGTTTC。GAPDH：Forward primer：CCCCCAATGTAT CCGTTGTG；Reverse primer：TAGCCCAGGATGCCCT TTAGT。

2.2.3 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系：10×Taqman RT buffer，1 μL；RNase free water，2 μL；25 mmol/L 氯 化 鎂（MgCl2）2.2 μL；Dntp mixture，0.5，Rnase inhibitor，0.2 μL；Multistreble Reverse Transprime，0.25；RNase Free H2O，Variable。輕輕混勻，分別按各樣本RNA的含量加入RNA，用 RNase free water補(bǔ)足 10 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：25℃ 10 min；48℃ 30 min；95℃ 5 min。

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法 使用ABI誖7300實(shí)時(shí)定量PCR儀，采用相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)方法。每個(gè)指標(biāo)每次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)6個(gè)不同的樣本，重復(fù)3次。反應(yīng)體系：2× Master Mix 12.5 μL；Forward primer and Reverse primer 0.5 μL；cDNA sample 0.5 μL；RNase Free H2O 11.5。熱循環(huán)條件參數(shù)如下：50℃ 30 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，40 cycles。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理 Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與拷貝量呈反對(duì)數(shù)關(guān)系。應(yīng)用ABI誖7300實(shí)時(shí)定量PCR儀分析軟件調(diào)整基線和閾值后，查看并分析反應(yīng)板數(shù)據(jù)，獲得每個(gè)樣品每次反應(yīng)的Ct值，計(jì)算得到其△Ct，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[6]。△Ct=Ct待測(cè)基因－Ct內(nèi)參照基因△△Ct=基因表達(dá)=2-△△Ct。

2.3 缺氧復(fù)氧神經(jīng)元caspase-3活性檢測(cè)以及蛋白質(zhì)定量

2.3.1 缺氧復(fù)氧神經(jīng)元caspase-3活性檢測(cè) 取處理好的接種于6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞，每孔加入0.125%胰酶 500 μL,消化 3~5 min，加入 100 μL 胎牛血清終止消化，加入1 mL冷PBS，輕輕吹打，并收集細(xì)胞到離心管中。4℃，800 r/min，離心5 min，輕輕吸去上清，加入3 mL冷磷酸鹽緩沖液（PBS），重新懸浮細(xì)胞，重復(fù)此步驟一次，轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管中，4℃，1 000 r/min，離心 5 min，小心吸去上清液。沉淀加入1×細(xì)胞裂解液，反復(fù)凍溶3次，4℃，500 r/min，離心5 min。取上清，采用Lowrry法測(cè)定裂解液中蛋白濃度。取上清液50 μL加入黑色酶標(biāo)板中，加入50 μL底物工作液，同時(shí)作空白對(duì)照。室溫，避光孵育30 min，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長460nm，光敏強(qiáng)度40。

caspase-3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），制成10 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液備用。取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，稀釋為 0、1、10、20、30、40、50、100 μmol/L 8個(gè)濃度，每個(gè)濃度做一個(gè)復(fù)孔。分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入黑色酶標(biāo)板中，加入50 μL底物工作液。室溫，避光孵育30 min，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.3.2 缺氧復(fù)氧神經(jīng)元caspase-3蛋白質(zhì)定量 采用Lowrry法測(cè)定蛋白含量：反應(yīng)液配制：將1 g碳酸鈉（Na2CO3）溶于 50 mL 0.2 mol/L NaOH 中，0.5 g明礬（CuSO4·5 H2O）溶于100 mL 1%酒石酸鈉溶液中。然后將前者50 mL與后者1 mL混合，備用。將Folin—酚試劑稀釋至1 mol/L，備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制25 g/L的牛血清白蛋白貯備液，稀釋至250，200，150，100，50，25，20，10，0 mg/L；取 11 支試管，編號(hào)，分別加入不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，以去離子水做空白對(duì)照，加入5 mL反應(yīng)液，漩渦混勻，室溫孵育30 min，再加入1 mLFolin—酚試劑，混勻，室溫孵育10 min，然后于500 nm處，1 cm光徑比色皿，測(cè)定吸光度。樣品測(cè)定：取20 μL細(xì)胞裂解上清液，稀釋至1 mL（稀釋50倍），加入5 mL反應(yīng)液，漩渦混勻，室溫孵育30 min，再加入1 mL 1 mol/L的Folin—酚試劑，混勻，室溫孵育10min，然后于500nm處，1 cm光徑比色皿，測(cè)定吸光度。

2.3.3 數(shù)據(jù)處理 1）蛋白含量：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和R2值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白含量，見圖1。

圖1 蛋白含量曲線圖

蛋白含量=（樣品吸光度-0.002 6）×50/0.000 5

2）caspase-3含量：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和R2值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算caspase-3含量。

3）caspase-3-like-activity=[（樣品吸光度-78.426）/28.594]/蛋白含量

3 結(jié)果

結(jié)果表明，H/R組Bax表達(dá)顯著升高，與control組比較有顯著差異（P<0.05），PNS可以顯著降低Bax表達(dá)，50、10 mg/L與H/R組比較有顯著性差異（P<0.05）；H/R組Bcl-2表達(dá)明顯降低，與control組比較有顯著差異（P<0.05），PNS可以增加Bcl-2表達(dá)，50 mg/L與H/R組比較有顯著性差異（P<0.05）；H/R組caspase-3表達(dá)有升高的趨勢(shì)，PNS有降低caspase-3表達(dá)的趨勢(shì)，但無顯著差異。H/R組caspase-3活性明顯升高，與control比較有顯著性差異（P<0.05），PNS 50、10、2 mg/L各劑量組均能夠抑制caspase-3的活性，有劑量依賴性趨勢(shì)。見表1，見表2。

表1 PNS對(duì)缺氧復(fù)氧致CNC損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響（s）

表1 PNS對(duì)缺氧復(fù)氧致CNC損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響（s）

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05,與H/R比較，*P<0.05。

組別對(duì)照組H/R H/R+PNS 50 mg/L H/R+PNS 10 mg/L H/R+PNS 2 mg/L caspase-3 0.66±0.08 0.83±0.11 0.73±0.25 0.79±0.24 0.82±0.31 n66666 Bcl-2 1.29±0.29 0.77±0.10#1.21±0.44*1.08±0.26 0.94±0.35 Bax 0.72±0.04 1.06±0.26##0.75±0.21*0.76±0.14*0.92±0.23

表2 PNS對(duì)缺氧復(fù)氧致CNC損傷神經(jīng)元caspase-3活性的影響

4 討論

Bcl-2、Bax同屬于B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族，但卻具有相反的作用，前者可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，后者能夠促進(jìn)凋亡的發(fā)生。Bcl-2與Bax結(jié)合形成異源二聚體使其失活，當(dāng)Bcl-2磷酸化，Bax表達(dá)增多或是Bad取代Bax與Bcl-2結(jié)合后，Bax隨即獲釋而形成誘導(dǎo)死亡的同源二聚體，進(jìn)入線粒體破壞其膜的通透性，將細(xì)胞色素C和Apaf-1釋放至胞漿[1-2]。在ATP存在的情況下，細(xì)胞色素C能與Apaf-1形成復(fù)合體，該復(fù)合體可以活化caspase-9，再激活caspase-3，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過特異性地裂解其底物而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2較多時(shí)，Bcl-2和Bax的異源二聚體增多，凋亡趨勢(shì)減弱；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax較多時(shí)，Bax本身形成的同源二聚體占主導(dǎo)，則易于發(fā)生凋亡。所以Bcl-2/Bax比值對(duì)于決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)具有重要意義。PNS可以抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)，增加抑制凋亡基因Bcl-2。一方面，Bcl-2可以Bcl-2和Bax的形成異源二聚體，直接發(fā)揮抗凋亡作用，另一方面，可以調(diào)節(jié)線粒體MPTP的開閉。線粒體是Bcl-2蛋白和Bax蛋白在細(xì)胞內(nèi)的主要分布部位，Bcl-2蛋白對(duì)線粒體主要功能之一是通過調(diào)節(jié)線粒體膜上的MPTP[7]，線粒體MPTP孔位于富含Bax、Bcl-2的地方。由于Bax和Bcl-2有不同的離子選擇性，Bax促進(jìn)MPTP孔開放，釋放CytC，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bcl-2、抑制MPTP孔開放，阻止細(xì)胞凋亡。

研究結(jié)果顯示，在適宜的濃度范圍內(nèi)，PNS使Bcl-2基因的表達(dá)上調(diào)，Bax基因的表達(dá)下調(diào)，PNS有抑制caspase-3mRNA的表達(dá)，抑制caspase-3活性的趨勢(shì)，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體膜上的凋亡相關(guān)蛋白，一方面，減少線粒體膜電位喪失，抑制MPTP的開放，另一方面直接抑制凋亡的發(fā)生；PNS可能是通過上述途徑，調(diào)節(jié)了線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，凋亡相關(guān)的幾個(gè)環(huán)節(jié)，而發(fā)揮抗凋亡作用的。

[1]Otter I,Conus S,Ravn U,et al.The binding properties and the biological activities of Bcl-2 and Bax in cells exposed to apoptotic stimuli[J].J Biol Chem,1998,273:6110-6120.

[2]Gross A,Jockel J,Wei MC,Korsmeyer SJ.Enforced dimerization of BAX results in its translocation,mitochondrial dysfunction and apoptosis[J].EMBO 1998,17:3878-3885.

[3]商洪才.丹酚酸A神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)評(píng)價(jià)及機(jī)制[D].天津中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文集.天津:天津中醫(yī)藥大學(xué),2005:165.

[4]S Yoshimura.Ceramide formation leads to caspase-3 activation during hypoxic PC12 cell death[J].Biol Chem,1998(273)：6921-6928.

[5]B Vasir,LP Aiello,KH Yoon,et al.Hypoxia induces vascular endothelial growth factor gene and protein expression in cultured rat islet cells[J].Diabetes,1998，(47):1894-1903.

[6]Brenner C,Marzo I,Kroemer G.A revolution in apoptosis:from a nucleocentric to a mitochondriocentric perspective[J].Exp Gerontol,1998,33:543-553.

[7]Susin SA,Lorenzo HK,Zamzami N,et al.Molecular characterization ofmitochondrial apoptosis2inducing factor[J].Nature,1999,397:441-446.