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        遼東楤木葉總皂苷對荷瘤小鼠抑瘤作用的實驗研究

        2010-06-02 08:36:10尹麗穎邊曉燕肖洪彬
        中醫(yī)藥信息 2010年3期
        關(guān)鍵詞:小鼠模型

        尹麗穎,邊曉燕,肖洪彬

        (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

        中藥遼東楤木系五加科楤木屬植物,具有補氣安神、強精補腎、祛風(fēng)活血、除濕止痛之功效。其化學(xué)成分以皂苷類為主,總皂苷成分具有抗變態(tài)反應(yīng)、保肝、降血脂、耐缺氧等多種藥理活性[1,2]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),遼東楤木葉的總苷成分還具有較強的抗腫瘤作用[3,4]。因此,采用 H22荷瘤小鼠為研究對象,從形態(tài)學(xué)角度進一步研究遼東楤木葉總皂苷對抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,并闡明其作用機理。

        1 材料與方法

        1.1 動物與瘤株

        清潔級昆明種小鼠30只,體重(20±2)g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,雌雄各半;H22腹水型小鼠肝癌細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

        1.2 藥物與試劑

        遼東楤木葉總皂苷(ETS)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室提供;環(huán)磷酰胺(CTX)由江蘇恒瑞制藥廠生產(chǎn),批號06111521。

        1.3 儀器

        荷蘭TECNAIG2型透射電子顯微鏡;德國萊卡超薄切片機;OLYMPUS(COVER-018型)生物顯微鏡。

        1.4 動物造模與分組

        取體重(20±2)g昆明種小鼠30只,雌雄各半,無菌條件下取第8d轉(zhuǎn)移癌 H22腹水(計活細(xì)胞大于95%),用0.9%生理鹽水1∶3稀釋后,每只鼠右側(cè)腋部皮下注射0.2mL瘤細(xì)胞懸液,然后將荷瘤鼠隨機分為三組即模型組、ETS組、CTX組,每組10只。

        1.5 給藥方法與劑量

        模型組:生理鹽水灌胃 20mL·(kg·d)-1,腹部皮下注射生理鹽水10mL·(kg·d)-1。

        ETS組:ETS 灌胃 100mg·(kg·d)-1,腹部皮下注射生理鹽水10mL·(kg·d)-1。

        CTX 組:生理鹽水灌胃 20mL·(kg·d)-1,腹部皮下注射 CTX 30mg·(kg·d)-1。

        以上各組均在實驗第2d開始用藥,每日1次,連續(xù)10d,禁食12h后處死小鼠,剝離瘤組織。

        1.6 取材

        小鼠斷頸處死后,剝離腫瘤組織,剔凈周圍的結(jié)締組織,稱重后迅速分別放入4%多聚甲醛和3%戊二醛固定液中固定。

        光鏡樣品制備:常規(guī)石蠟包埋,切片,二甲苯脫蠟,HE染色,待光鏡觀察。

        電鏡樣品制備:戊二醛前固定,PBS緩沖液沖洗,1%鋨酸后固定,PBS緩沖液沖洗,乙醇、丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂812浸透、包埋、聚合,半薄切片定位,超薄切片,醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色,待透射電鏡觀察。

        1.7 觀察指標(biāo)

        瘤體取出后依次稱重,計算抑瘤率,抑瘤率=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)∕對照組平均瘤重×100%。腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。

        1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

        應(yīng)用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,兩組間比較用t檢驗,結(jié)果以(±s)表示。

        2 結(jié)果

        2.1 小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率 結(jié)果見表1。

        表1 對H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制情況(±s)

        表1 對H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制情況(±s)

        注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

        10 0.94±0.36 ETS組 10 0.43±0.12** 54.3 CTX組 10 0.24±0.09**模型組74.5

        2.2 腫瘤病理形態(tài)學(xué)觀察

        模型組:瘤細(xì)胞生長旺盛,細(xì)胞體積大,核染色深大小不一,病理核分裂相較多,瘤組織內(nèi)新生微血管豐富。見圖1。

        圖1 HE模型組400X

        CTX組:腫瘤組織較局限,細(xì)胞體積變小,瘤體中央可見片狀壞死,部分可見結(jié)締組織包繞,瘤組織內(nèi)微血管較少見。見圖2。

        圖2 HE CTX組400X

        ETS組:瘤組織呈小片狀生長,瘤細(xì)胞體積較小,大面積壞死核碎裂,瘤體邊緣較整齊,周圍組織少有侵襲,瘤組織內(nèi)及其周圍微血管明顯減少或偶見。瘤周和間質(zhì)內(nèi)有許多淋巴細(xì)胞浸潤。見圖3。

        圖3 HE ETS組400X

        2.3 腫瘤透射電鏡觀察

        模型組:瘤細(xì)胞多呈圓形或不規(guī)則形,排列緊密,間隙正常,細(xì)胞表面可見微絨毛豐富,細(xì)胞核較大,結(jié)構(gòu)完整,核膜清晰,核仁明顯。見圖4。

        圖4 模型組4200×

        CTX組:腫瘤細(xì)胞大部分發(fā)生崩解、壞死現(xiàn)象,細(xì)胞膜破裂、不完整,胞質(zhì)內(nèi)無明顯細(xì)胞器結(jié)構(gòu),細(xì)胞固縮,間隙增寬,呈溶解樣改變。其中可見凋亡細(xì)胞,染色質(zhì)凝集成塊,細(xì)胞膜融合。見圖5。

        圖5 CTX組4200×

        ETS組:瘤細(xì)胞體積明顯變小,細(xì)胞表面微絨毛減少或消失,核異染色質(zhì)濃縮成塊,向核周邊凝集,核周隙增寬,可見凋亡小體形成。見圖6。

        圖6 ETS組4200×

        3 討論

        隨著社會和自然環(huán)境的變化,惡性腫瘤的發(fā)病率逐年升高,已經(jīng)成為威脅人類生命健康的第二大疾病,全世界每年有600多萬人死于惡性腫瘤。西醫(yī)治療腫瘤主要是通過放療、化療、手術(shù)等手段,雖然有較好的療效但毒副作用較大,常出現(xiàn)免疫功能下降、骨髓抑制等不良反應(yīng),并且化療藥物在治療過程中出現(xiàn)的耐藥性已成為目前臨床治療中的難題之一。因此迫切需要尋求療效好、副作用小的藥物和方法來抵制腫瘤對人類的侵害。腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是由細(xì)胞增殖失控引起,也與細(xì)胞凋亡受阻密切相關(guān)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡是抗腫瘤藥物研究及應(yīng)用的重要策略之一。

        本實驗研究結(jié)果證明:與模型組比較,CTX組和ETS組瘤重顯著低于模型組的瘤(P<0.01),表明ETS具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示,CTX組、ETS組均可見腫瘤組織較局限,瘤細(xì)胞體積變小,細(xì)胞表面微絨毛減少甚至消失,內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完好,核膜清晰,細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)團塊狀散布核內(nèi)或邊集核膜下,并可見不規(guī)則凋亡小體,線粒體嵴等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)未見改變。進一步證明了遼東楤木葉總皂苷的抗腫瘤作用機制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

        [1]孫桂波,徐慧波.去葡萄糖竹節(jié)參皂苷IVa對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的保護作用[J].中國藥理與毒理學(xué)雜志,2005,19(6):424-427.

        [2]鈕旭升,陶樹青,馬志強,等.遼東楤木的化學(xué)成分研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2009,37(3):52-54.

        [3]肖洪彬,匡海學(xué).龍牙楤木葉抗腫瘤作用機理的實驗研究[J].中藥藥理與臨床,2000(增刊):16.

        [4]尹麗穎,邊曉燕,肖洪彬,等.遼東楤木葉總皂苷對H22荷瘤小鼠p53及PCNA蛋白表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2010,38(1):18-20.

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