尹麗穎，邊曉燕，肖洪彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥遼東楤木系五加科楤木屬植物，具有補氣安神、強精補腎、祛風(fēng)活血、除濕止痛之功效。其化學(xué)成分以皂苷類為主，總皂苷成分具有抗變態(tài)反應(yīng)、保肝、降血脂、耐缺氧等多種藥理活性［1，2］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，遼東楤木葉的總苷成分還具有較強的抗腫瘤作用［3，4］。因此，采用 H22荷瘤小鼠為研究對象，從形態(tài)學(xué)角度進一步研究遼東楤木葉總皂苷對抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并闡明其作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物與瘤株

清潔級昆明種小鼠30只，體重(20±2)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，雌雄各半;H22腹水型小鼠肝癌細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.2 藥物與試劑

遼東楤木葉總皂苷(ETS)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室提供;環(huán)磷酰胺(CTX)由江蘇恒瑞制藥廠生產(chǎn)，批號06111521。

1.3 儀器

荷蘭TECNAIG2型透射電子顯微鏡;德國萊卡超薄切片機;OLYMPUS(COVER－018型)生物顯微鏡。

1.4 動物造模與分組

取體重(20±2)g昆明種小鼠30只，雌雄各半，無菌條件下取第8d轉(zhuǎn)移癌 H22腹水(計活細(xì)胞大于95%)，用0.9%生理鹽水1∶3稀釋后，每只鼠右側(cè)腋部皮下注射0.2mL瘤細(xì)胞懸液，然后將荷瘤鼠隨機分為三組即模型組、ETS組、CTX組，每組10只。

1.5 給藥方法與劑量

模型組:生理鹽水灌胃 20mL·(kg·d)－1，腹部皮下注射生理鹽水10mL·(kg·d)－1。

ETS組:ETS 灌胃 100mg·(kg·d)－1，腹部皮下注射生理鹽水10mL·(kg·d)－1。

CTX 組:生理鹽水灌胃 20mL·(kg·d)－1，腹部皮下注射 CTX 30mg·(kg·d)－1。

以上各組均在實驗第2d開始用藥，每日1次，連續(xù)10d，禁食12h后處死小鼠，剝離瘤組織。

1.6 取材

小鼠斷頸處死后，剝離腫瘤組織，剔凈周圍的結(jié)締組織，稱重后迅速分別放入4%多聚甲醛和3%戊二醛固定液中固定。

光鏡樣品制備:常規(guī)石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，HE染色，待光鏡觀察。

電鏡樣品制備:戊二醛前固定，PBS緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定，PBS緩沖液沖洗，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂812浸透、包埋、聚合，半薄切片定位，超薄切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，待透射電鏡觀察。

1.7 觀察指標(biāo)

瘤體取出后依次稱重，計算抑瘤率，抑瘤率=(對照組平均瘤重－治療組平均瘤重)∕對照組平均瘤重×100%。腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組間比較用t檢驗，結(jié)果以(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率 結(jié)果見表1。

表1 對H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制情況(±s)

表1 對H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制情況(±s)

注:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

10 0.94±0.36 ETS組 10 0.43±0.12** 54.3 CTX組 10 0.24±0.09**模型組74.5

2.2 腫瘤病理形態(tài)學(xué)觀察

模型組:瘤細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞體積大，核染色深大小不一，病理核分裂相較多，瘤組織內(nèi)新生微血管豐富。見圖1。

圖1 HE模型組400X

CTX組:腫瘤組織較局限，細(xì)胞體積變小，瘤體中央可見片狀壞死，部分可見結(jié)締組織包繞，瘤組織內(nèi)微血管較少見。見圖2。

圖2 HE CTX組400X

ETS組:瘤組織呈小片狀生長，瘤細(xì)胞體積較小，大面積壞死核碎裂，瘤體邊緣較整齊，周圍組織少有侵襲，瘤組織內(nèi)及其周圍微血管明顯減少或偶見。瘤周和間質(zhì)內(nèi)有許多淋巴細(xì)胞浸潤。見圖3。

圖3 HE ETS組400X

2.3 腫瘤透射電鏡觀察

模型組:瘤細(xì)胞多呈圓形或不規(guī)則形，排列緊密，間隙正常，細(xì)胞表面可見微絨毛豐富，細(xì)胞核較大，結(jié)構(gòu)完整，核膜清晰，核仁明顯。見圖4。

圖4 模型組4200×

CTX組:腫瘤細(xì)胞大部分發(fā)生崩解、壞死現(xiàn)象，細(xì)胞膜破裂、不完整，胞質(zhì)內(nèi)無明顯細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，細(xì)胞固縮，間隙增寬，呈溶解樣改變。其中可見凋亡細(xì)胞，染色質(zhì)凝集成塊，細(xì)胞膜融合。見圖5。

圖5 CTX組4200×

ETS組:瘤細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞表面微絨毛減少或消失，核異染色質(zhì)濃縮成塊，向核周邊凝集，核周隙增寬，可見凋亡小體形成。見圖6。

圖6 ETS組4200×

3 討論

隨著社會和自然環(huán)境的變化，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為威脅人類生命健康的第二大疾病，全世界每年有600多萬人死于惡性腫瘤。西醫(yī)治療腫瘤主要是通過放療、化療、手術(shù)等手段，雖然有較好的療效但毒副作用較大，常出現(xiàn)免疫功能下降、骨髓抑制等不良反應(yīng)，并且化療藥物在治療過程中出現(xiàn)的耐藥性已成為目前臨床治療中的難題之一。因此迫切需要尋求療效好、副作用小的藥物和方法來抵制腫瘤對人類的侵害。腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是由細(xì)胞增殖失控引起，也與細(xì)胞凋亡受阻密切相關(guān)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡是抗腫瘤藥物研究及應(yīng)用的重要策略之一。

本實驗研究結(jié)果證明:與模型組比較，CTX組和ETS組瘤重顯著低于模型組的瘤(P<0.01)，表明ETS具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，CTX組、ETS組均可見腫瘤組織較局限，瘤細(xì)胞體積變小，細(xì)胞表面微絨毛減少甚至消失，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完好，核膜清晰，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)團塊狀散布核內(nèi)或邊集核膜下，并可見不規(guī)則凋亡小體，線粒體嵴等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)未見改變。進一步證明了遼東楤木葉總皂苷的抗腫瘤作用機制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

［1］孫桂波，徐慧波.去葡萄糖竹節(jié)參皂苷IVa對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的保護作用［J］.中國藥理與毒理學(xué)雜志，2005，19(6):424－427.

［2］鈕旭升，陶樹青，馬志強，等.遼東楤木的化學(xué)成分研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2009，37(3):52－54.

［3］肖洪彬，匡海學(xué).龍牙楤木葉抗腫瘤作用機理的實驗研究［J］.中藥藥理與臨床，2000(增刊):16.

［4］尹麗穎，邊曉燕，肖洪彬，等.遼東楤木葉總皂苷對H22荷瘤小鼠p53及PCNA蛋白表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(1):18－20.