李方，曹陽，張清波

(1.黑龍江省藥品檢驗(yàn)所，黑龍江 哈爾濱 150001;2.大慶市藥品檢驗(yàn)所，黑龍江 大慶 163316)

白蒲黃片由白頭翁、蒲公英、黃芩、黃柏四味藥組成，具有清熱涼血、解毒消炎的功效，用于治療腸炎、痢疾等疾病。原標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第2冊(cè)，僅收載理化鑒別［1］，為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，本研究增訂了黃芩、黃柏的薄層色譜鑒別;同時(shí)采用高效液相色譜法測定處方中黃芩所含黃芩苷的含量，提高后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)，含量測定方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可較好地控制質(zhì)量。

1 儀器及試藥

高效液相色譜儀(紫外檢測器，美國Waters);CAMAG PEPROSTAR 3薄層色譜成像系統(tǒng)(瑞士卡馬公司)。

黃芩苷對(duì)照品:購于中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110715－200514，供含量測定用。

白蒲黃片樣品:哈爾濱蒲公英藥業(yè)有限公司，批號(hào):20070701、20070702、20070703;吉林吉春制藥有限公司，批號(hào):071203、071002、070501;黑龍江濟(jì)仁藥業(yè)有限公司，批號(hào):080402。

所用溶劑均為分析純，流動(dòng)相配制用色譜純?nèi)軇?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩TLC鑒別

取本品4g，糖衣片除去糖衣，研細(xì)，加甲醇40mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?.5mol·L－1鹽酸溶液20mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，水層備用，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄ⅣB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一含4%醋酸鈉的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(5∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾(見圖1)。

圖1 黃芩薄層色譜圖(4%醋酸鈉浸泡)

2.2 黃柏TLC鑒別

取《中國藥典》2005版黃芩［鑒別］項(xiàng)下的水溶液，用氨試液調(diào)節(jié)pH值至12，再用三氯甲烷振搖提取2次，每次20mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材0.1g，加甲醇10mL，超聲處理30min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄ⅣB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液1～2μL，對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－冰醋酸－水(7∶2∶4)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾(見圖2)。

圖2 黃柏鑒定薄層色譜圖UV365nm

2.3 含量測定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含20μg的溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去糖衣，精密稱定，或取重量差異項(xiàng)下的本品(薄膜衣片)，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇 50mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率40KHz)30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2.3.3 陰性對(duì)照液的制備 取缺黃芩樣品，稱取相當(dāng)于供試品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照液。

2.3.4 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(150nm×4.6mm，5μm);甲醇－水－磷酸(43∶57∶0.2)為流動(dòng)相;檢測波長為280nm;進(jìn)樣量:對(duì)照溶液與供試品溶液各10μL;流速1mL·min－1。在上述色譜條件下，樣品中黃芩苷與其他組分分離較好(見圖3、4、5)。

圖3 對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

圖4 供試品溶液HPLC色譜圖

圖5 白蒲黃片缺黃芩的陰性樣品溶液HPLC色譜圖

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密稱取減壓干燥12h以上的黃芩苷對(duì)照品11.05mg，置100mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取2.0mL，置10mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密吸取上述溶液 2、5、10、15、20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度對(duì)峰面積求回歸，結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

回歸方程為:y=3766905.718x－11329.28，線性范圍為0.04420μg～0.442μg，相關(guān)系數(shù) r=1.0000。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取0.0221mg·mL－1的黃芩苷對(duì)照品溶液，精密吸取10μL進(jìn)樣，連續(xù)測定5次，以峰面積積分值計(jì)算，RSD=0.5%。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為20070702供試品溶液，按含量測定方法，分別在 0、3、6、9、12、15、18、24h進(jìn)行測定，結(jié)果表明:供試品溶液24h內(nèi)基本穩(wěn)定。所得黃芩苷的峰面積RSD為0.3%(n=8)。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)為20070702)6份，按供試品溶液制備方法制備，分別測定，以供試品含量計(jì)算，RDS=1.2%，證明此方法重現(xiàn)性良好。

2.3.9 回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)(批號(hào)為20070702，含量1.10497mg·g－1)的樣品6份，分別精密加入黃芩苷對(duì)照品，按供試品溶液同法制備加樣回收溶液，分別測定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，該方法回收率良好。結(jié)果見表2。

2.3.10 樣品含量測定

按規(guī)定方法制備7批樣品溶液及對(duì)照品溶液，分別測定，測定結(jié)果見表3。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 樣品的測定結(jié)果

3 討論

3.1 通過紫外掃描，黃芩苷溶液在277nm波長處有最大吸收，參照《中國藥典》2005年版一部黃芩含量測定項(xiàng)下檢測波長為280nm，最終確定檢測波長為280nm。

3.2 采用二極管陣列檢測器對(duì)被測成份黃芩苷的純度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與對(duì)照品光譜圖基本一致，說明被測峰基本為單一物質(zhì)。

3.3 50%甲醇提取時(shí)間考察 取本品適量，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲提取 20min、30min、40min，放冷，照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，考察50%甲醇提取時(shí)間對(duì)測定結(jié)果的影響。結(jié)果以甲醇超聲提取30min，即可將樣品中黃芩苷提取完全。

3.4 由于各廠家生產(chǎn)工藝和投料的藥材差異，導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)的含量測定數(shù)據(jù)相差較大，因此更加有必要增加黃芩苷的含量測定，以進(jìn)一步控制該藥品的質(zhì)量。