李成葉,邱昌偉,,王金秋,林德貴

(1.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院,湖北武漢430070;2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京海淀100193)

犬乳腺腫瘤在獸醫(yī)臨床中非常常見,母犬乳腺瘤發(fā)病率約占全部腫瘤性疾病的25%～42%[1]。其早期治療主要依靠外科切除的方法,但對已經轉移的犬乳腺腫瘤,通過手術切除后也可能復發(fā)。為延長患病犬的生命,我們可以選用化療藥物來抑制腫瘤細胞的增殖。長春新堿(vincristine,VCR)是常用的抗腫瘤藥物,現已發(fā)現可以抑制一些人腫瘤細胞的增殖[2-3],并可以影響一些細胞的周期[4-5]。VCR是否對體外培養(yǎng)的犬乳腺癌細胞有抑制作用,國內還未見有這方面的報道,為此,我們進行了這方面的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 體外培養(yǎng)的犬乳腺癌細胞(CMT1211):由本研究原代培養(yǎng)并通過鑒定;長春新堿:購自廣州白云山明興制藥有限公司,批號050903,用 PBS配成 4 μ g/mL儲存液;M TT 和DMSO均購自Sigma公司;六孔培養(yǎng)板:Costar公司;胎牛血清:Hyclone;公司流式細胞儀:美國B-D公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞增殖抑制試驗 收集對數生長期的細胞,按 0.5×104/孔于 200 μ L培養(yǎng)液中接種 96孔板,在37℃、5%CO2條件下過夜后,加入不同濃度的VCR,對照組加入相應體積的PBS,每組設4個平行孔。用藥后再分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,每孔加入20 μ L MT T(5 mg/mL)后再培養(yǎng) 4 h,傾去培養(yǎng)液,每孔加入 100 μ L DMSO 溶解,待完全溶解后,于酶標免疫測定儀上以波長為490 nm,測定其吸光度(重復3次試驗)。根據公式:細胞增殖抑制率(%)=(1-處理組的吸光度/對照組吸光度)×100%,計算出抑制率。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡 將吹打均勻的犬乳腺癌細胞(CM T1211)平均接種到6孔細胞培養(yǎng)板中,24 h后換培養(yǎng)液。分別用 0.5 μ g/mL 、1 μ g/mL 、2 μ g/mLVCR 作用于細胞 6 h 、12 h、24 h后,觀察細胞的形態(tài),用0.02%胰酶-EDTA將培養(yǎng)孔中的細胞消化,0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液洗2次,1 000 r/min離心8 min,用300 μ L 0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液制成懸浮的單細胞懸液,再將700 μ L 100%冷乙醇緩慢加入,固定細胞,使乙醇的濃度最終為70%,置于4℃冰箱保存至少固定 18 h。完全去除乙醇后,0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液清洗固定的細胞懸液2次,1 000 r/min離心10 min。在細胞懸液中加入PI染色液使之濃度為50 μ g/mL,37℃作用 30 min,于流式細胞儀分析細胞周期和細胞凋亡,每組均重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件中的方差分析進行統(tǒng)計學處理。

2 試驗結果

2.1 細胞增殖抑制試驗結果 不同濃度的VCR處理CM T1211細胞,由表1可知,隨濃度增加其抑制率增加(P＜0.01)。

2.2 細胞凋亡和細胞周期的檢測結果 由表2可知,在同一時間內,各藥物濃度的G0/G1、G2/M 分別與對照組比較,差異不顯著(P＞0.05),但細胞凋亡率隨著時間的延長而增加(P＜0.01);同一濃度內,不同處理時間的G0/G1、G2/M 與對照組相比較,差異亦不顯著(P＞0.05),隨著VCR濃度的增強,細胞凋亡率也在增加(P＜0.01)。

表1 MTT法測定VCR對CMT1211細胞的影響

3 討論

細胞凋亡最早由Kerr等根據形態(tài)表現而命名的,它是細胞死亡方式之一,具有特殊形態(tài)改變的程序性死亡方式[6]。細胞凋亡后從形態(tài)到功能等都發(fā)生一系列的變化,具有共同的基本特征[7-8]。目前腫瘤化療策略主要集中于抑制腫瘤細胞增殖或/和誘導細胞凋亡。細胞凋亡是多種因素控制的主動性細胞死亡過程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,凋亡起著很重要的作用。細胞凋亡為腫瘤防治提供了新的思路,現在研究發(fā)現很多抗癌藥物能誘導腫瘤細胞凋亡[9]。長春新堿(VCR)是1962年由長春花中提出的二聚吲哚類化合物,主要存在于長春花葉中[10],臨床上用于治療急性淋巴細胞白血病、何杰金及非何杰金淋巴瘤有確切療效。有關VCR抗腫瘤作用在人醫(yī)方面的報道比較多,但在臨床獸醫(yī)中還未見有報道,為此我們原代培養(yǎng)了1株犬乳腺癌細胞系,該細胞系現已穩(wěn)定傳了接近80代,細胞性狀穩(wěn)定,呈典型的上皮樣貼壁生長,我們將其命名為CMT1211[11]。

表2 不同濃度的VCR處理CMT1211細胞不同時間對細胞周期及凋亡的影響

VCR主要是通過抑制細胞微管蛋白聚集和干擾細胞蛋白質、脂類、氨基酸及核酸代謝而起抗癌作用[12]。在細胞增殖周期中,在G1期和S期之間以及G2期和M期之間,存在著影響細胞周期進行的控制點,而藥物可能通過調控這些控制點來影響細胞增殖。不同的化療藥物可影響細胞周期的不同階段 。而我們的試驗結果發(fā)現,0.5 μ g/mL 、1 μ g/mL 、2 μ g/mL VCR分別處理CMT1211細胞后,其 G0/G1、G2/M 期細胞變化不明顯。此結論與唐旭東等報道-隨著VCR濃度的升高和作用時間的延長G0/G1期細胞明顯下降、G2/M期細胞明顯升高不一致[12]。本試驗通過FCM分析,揭示了VCR這種藥物具有誘導犬乳腺癌細胞凋亡的作用,且此作用與藥物的濃度和作用時間有關。但是本試驗僅從VCR誘導犬乳腺腫瘤細胞凋亡一個方面做了研究,有關VCR抗犬乳腺腫瘤作用的其他方面還有待于進一步研究。

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