余 多,王李梁,孫 淼,李金彩,陳福勇

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

J亞型禽白血病(avian leukosis subgroup J)是由J亞型禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,A LV-J)引起的一種腫瘤性疾病。該病毒感染率高,發(fā)病率低,可通過水平和垂直兩種方式傳播感染雞群。ALV-J最早由 Payne L N等在1988年從肉雞中分離出來的[1]。我國在1999年首次從商品肉雞中分離到J亞型禽白血病病毒[2]。ALV-J主要引起肉雞全身性血管瘤和髓性細胞瘤,表現(xiàn)為肝脾腫大,其上有彌散性細小腫瘤結(jié)節(jié),胸骨和肋骨也可出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)[3]。發(fā)病肉種雞消瘦、雞冠蒼白,嚴重生長發(fā)育不良。蛋雞也可感染該病,患病蛋雞產(chǎn)蛋率明顯低于標(biāo)準水平,在開產(chǎn)到產(chǎn)蛋高峰前后最高死亡率可達5%～15%左右。感染該病還可使飼料報酬率低,死淘率升高,給世界各國養(yǎng)禽業(yè)帶來很大的危害[5]。ALV-J有經(jīng)種蛋垂直傳播和水平傳播兩種傳播方法。先天感染的子代雞發(fā)生免疫耐受,導(dǎo)致免疫抑制,影響疫苗免疫效果,降低雞體對其他病原的抵抗力,引起更嚴重的危害。

ALV-J基因組主要包括gag,pol和env 3個基因[6]。其中g(shù)ag和pol基因相對保守,而env基因卻存在較大的變異。env基因編碼的表面囊膜蛋白gp85是其亞型特異性蛋白。

對ALV-J的診斷主要是檢測抗體。國外已經(jīng)有商品化試劑盒,但價格昂貴,難以廣泛使用。本研究主要進行ALV-J S1毒株g p85基因的克隆表達,在此基礎(chǔ)上以gp85蛋白為包被抗原,建立檢測ALV-J抗體檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞 J亞型禽白血病病毒(編號S1),由本實驗室分離鑒定。培養(yǎng)病毒的細胞是 DF-1細胞。

1.2 臨床血清樣本 來源于某養(yǎng)雞場,該雞群曾感染過A LV-J。

1.3 引物設(shè)計合成 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的J亞型禽白血病病毒序列,設(shè)計引物 Sense:5′-GGA TCC GCC ACC A TG GGA G TT CAT CTG T TG CAA CAA CCA-3′,5′端加入 Bam H Ⅰ 位 點,Antisense:5′-AAG CTT G GCG CCT GCT ACG GCG GTG-3′,5′端加入 Hin dⅢ位點,用于表達 gp85基因。Sense和Antisense之間為完整的g p85基因閱讀框。引物由北京奧科生物有限公司合成。

1.4 gp85基因擴增 以重組質(zhì)粒pMD19-S1-gp85為模板,擴增J亞型禽白血病病毒S1的gp85基因。

1.5 重組表達質(zhì)粒p ET 28a-S1-Jgp85的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物連接T載體,經(jīng)雙酶切、回收后連接于表達載體p ET 28a,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。陽性菌送往北京諾賽生物有限公司測序鑒定。

1.6 gp85基因的原核表達與蛋白純化 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21(DE3),用1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達,按照分子生物學(xué)實驗指南[7]介紹方法純化包涵體His-S1-Jgp85蛋白。

1.7 間接ELISA方法的建立 用重組蛋白His-S1-Jgp85作為包被抗原,以IDEXX公司的J亞型抗體檢測試劑盒標(biāo)準陰陽性為陰陽性對照,建立間接 ELISA方法,用于檢測J亞型禽白血病抗體。

1.7.1 重組抗原包被濃度和待檢血清稀釋濃度確定 用包被液將His-S1-Jgp85蛋白分別作2倍比稀釋,包被酶標(biāo)板,4℃包被12 h,洗滌3次,加入5%脫脂乳,4℃封閉過夜。洗滌后加入2倍比稀釋的陰陽性血清,100μL/孔,37℃反應(yīng)1 h;洗滌后每孔加入100μL稀釋好的 HRP兔抗雞 IgG(1∶5000),37℃反應(yīng)30 min,洗滌后加入底物,100μL/孔,室溫避光顯色15 min,加入終止液50μL終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀出OD450,選擇陽性值在0.9～1.1和陰性值低(即P/N最大)的稀釋度作為包被濃度和血清稀釋度。

1.7.2 酶標(biāo)抗體工作濃度確定 將HRP-兔抗雞IgG按2倍比稀釋,其他條件為最佳條件,操作同

1.7.1 。比較陰陽性血清的OD450和P/N值,以確定酶標(biāo)抗體最佳工作濃度。

1.7.3 陰陽性臨界值確定 用已建立的間接ELISA方法檢測50份ALV-Jgp85陰性血清,按照已確立的ELISA方法進行測定,計算出50份血清的平均值(X)和標(biāo)準方差(SD),陰陽性臨界值等于X+3SD。

1.7.4 特異性試驗 用已建立好的間接ELISA方法檢測 REV 、REO 、ND、MD、ALV-A B陽性血清,同時做ALV-J陽性和陰性血清對照,每份重復(fù)兩個孔。

1.7.5 符合性試驗 用建立的間接ELISA方法38份經(jīng)IDEXX鑒定陽性的血清。

1.7.6 臨床應(yīng)用 用建立的間接ELISA方法對某規(guī)模雞場的92份臨床血清進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組表達質(zhì)粒pET28a-S1-Jgp85的 PCR鑒定 重組質(zhì)粒用特異性引物擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果表明,陰性對照成立的前提下,在921 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。見圖 1。

圖1 重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.2 重組表達質(zhì)粒pET 28a-S1-Jgp85雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)Bam H I和 Hin d III雙酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果表明,在5.4 kb的載體pET28a處出現(xiàn)一條清晰條帶,與p ET28a空載體雙酶切后片段大小一致,且在921 bp處出現(xiàn)一特異性目的條帶,與預(yù)期結(jié)果相符。證明目的基因已插入載體中。見圖2。

2.3 g p85基因的原核表達 重組質(zhì)粒p ET 28a-S1-Jgp85轉(zhuǎn)化BL21(DE3)的表達產(chǎn)物在蛋白質(zhì)分子量約40 kD顯示出清晰的條帶,而陰性對照空載體pET 28a表達產(chǎn)物沒有顯示相應(yīng)條帶。見圖3。

2.4 重組蛋白Western blot鑒定 將pET 28a空載體誘導(dǎo)菌和p ET 28a-Jgp85重組誘導(dǎo)菌轉(zhuǎn)至PV DF膜上,與ALV-J陽性血清反應(yīng),結(jié)果表明,大約在40 kD處出現(xiàn)蛋白條帶,空載體誘導(dǎo)菌沒有出現(xiàn)任何條帶。可見ALV-S1-J gp85基因在大腸桿菌內(nèi)被誘導(dǎo)表達后得到的重組蛋白都可以被A LVJ陽性血清所識別,說明p ET28a-Jgp85重組蛋白有良好的抗原性。見圖4。

圖4 重組蛋白Western blot鑒定

2.5 重組蛋白包被濃度和待檢血清稀釋度確定在抗原包被濃度1μg/mL～10μg/m L之間時,隨著抗原包被濃度上升,陰陽性血清OD450值逐漸增大。隨著陰陽性血清稀釋度增大,二者的OD450值則逐漸降低。選擇陽性血清OD450值在0.9～1.1,而陰性血清OD450值低(即P/N值最大)時的稀釋度為最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度。結(jié)果顯示,抗原包被最佳濃度為5μg/m L,血清稀釋度為1∶500(表1)。

表1 抗原包被濃度和待檢血清稀釋度確定

2.6 酶標(biāo)抗體最佳工作濃度確定 隨著酶標(biāo)抗體濃度降低,陰陽性血清OD450值隨之降低,選擇陽性血清OD450值在 0.9～1.1,而陰性血清OD450值低(即P/N值最大)時的稀釋度為酶標(biāo)抗體最佳工作濃度,結(jié)果顯示,酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為 1∶5000(表2)。

表2 酶標(biāo)抗體工作濃度確定

2.7 陰陽性臨界值確定 50份陰性血清OD450的平均值(X)為0.132,標(biāo)準差(SD)為0.018,判定陰陽性臨界值(X+3SD)為0.19,因此,若待檢血清的OD450值≥0.19,則判為陽性;若待檢血清的OD450值小于0.19,則判為陰性。

2.8 特異性試驗 用建立的ELISA方法檢測REV、REO、ND、MD、ALV-AB 的陽性血清,其OD450平 均 值分 別為 0.0995、0.1070、0.1095、0.1150、0.1560,均小于臨界值 0.19,表明 Jgp85重組蛋白與 REV、REO、ND、MD、A LV-A B陽性血清沒有交叉反應(yīng),說明本研究建立的間接ELISA方法具有良好的特異性,可用于ALV-J抗體的檢測。

2.9 符合性試驗 本試驗建立的方法檢測出34份陽性,符合率為89.4%,檢測陰性的血清其OD450分別為 0.1890,0.1790,0.1870,0.1660,略小于臨界值。

2.10 臨床試驗 用建立的間接ELISA方法檢測雞場送檢的92份血清樣本,并同時用IDEXX的ELISA試劑盒做比較。本試驗建立的方法共檢出6份陽性,陽性率為6.4%;IDEXX試劑盒共檢出8份陽性,陽性率為8.7%。本試驗方法檢出的6份樣本與IDEXX試劑盒的符合率為97.8%。

3 討論

現(xiàn)階段,對A LV-J沒有可靠的治療方法,也沒有有效的疫苗可供使用。通過檢測淘汰陽性雞是凈化該病的主要措施。國內(nèi)診斷ALV-J的主要手段是檢測ALV-J的抗體,國外已經(jīng)有商品化的試劑盒,但ALV-J的gp85基因存在極為普遍的變異,世界各地ALV-J分離株 gp85基因的變異規(guī)律也不相同,不能保證國外試劑盒能適用于中國,而且國外試劑盒價格昂貴,難以推廣使用。

本研究通過克隆表達A LV-J河北分離株的g p85基因,并用gp85蛋白作為包被抗原,建立間接ELISA方法檢測A LV-J抗體,并檢測了某雞場的92份血清樣本,最終建立了能特異性檢測J亞群禽白血病血清抗體的ELISA方法,為生產(chǎn)中快速檢測A LV-J提供了一種便利的方法,對J亞群禽白血病的凈化有深遠的意義。

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