祝永琴,劉茂軍,邵國青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇南京210095)

一個生物的全部DNA序列稱作該生物的基因組(geneome),基因(gene)是基因組中有關蛋白質(zhì)遺傳信息的編碼單位?；蚪M學是關于基因組結構、基因功能以及基因組比較的一門科學。支原體(Mycoplasma)由于基因組比較小,是屬于最早被進行基因組測序的微生物物種之一。1995年10月,人類完成了第一個原核生物,即生殖支原體G37株的基因組測序。目前已完成了17株支原體基因組測序。本文主要介紹一下豬肺炎支原體基因組結構特點。

1 豬肺炎支原體

豬肺炎支原體(Mhp),是引起豬支原體肺炎(MPS)的主要病原體。該病以接觸性、高度傳染性、高發(fā)病率和低死亡率為特點[1],主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難,其主要危害是引起豬的生長受阻和飼料轉化率嚴重下降,而且很容易繼發(fā)其他病原的感染,誘導形成慢性肺炎。本病流行范圍廣,且難以治愈,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,嚴重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,是世界上最主要的豬病之一[2]。目前,已經(jīng)完成3株豬肺炎支原體的基因組測序,它們是7448型,J株以及232型。

2 豬肺炎支原體基因組結構

2.1 一般特征 豬肺炎支原體232型基因組892 758 bp,平均G+C含量 28.6%,推測有692個CDS(編碼序列),編碼的蛋白質(zhì)大小平均約388個氨基酸。692個CDS中,304個編碼具有功能作用的蛋白(約44%),261個編碼保守的假定蛋白,127個編碼特征性假定蛋白[3]。其基因組中有一個獨立的16S-23S rRNA操縱子基因,一個5S rRNA,它位于距離23S rRNA基因100 kb處,還有30個tRNA編碼基因。基因組中含有很多基因家族,占總編碼序列的26.3%。豬肺炎支原體7448型以及J株的基因組特點與232型有一定的差異,它們的基因組特點見表1[4]。

表1 豬肺炎支原體7448型以及J株基因組一般特征

2.2 基因組結構 與其他支原體不同,豬肺炎支原體中幾乎不存在重復序列,但是其粘附因子P97中存在重復序列,同時P97操縱元下游的P102蛋白中也存在重復序列。啟動子下游310 bp處可能編碼脂蛋白的mhp288中也存在 10.6個重復序列(CTACCCAAAAAGATCAAA)。豬肺炎支原體重復序列的分析結果顯示,它的最小長度為25 bp,出現(xiàn)頻率最高的重復序列是反向互補的。

2.3 復制起始區(qū) 豬肺炎支原體rpmH和dnaA基因間存在長348 bp的基因間區(qū)域,dnaA和dnaN基因間存在長148 bp的基因間區(qū)域。這些基因間區(qū)域內(nèi)存在T TATC(C,A)A(C,A)編碼的dnaA盒[5],在dnaA上游基因間區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)有兩個DnaA盒,而在dnaA和dnaN之間的區(qū)域內(nèi)沒有DnaA盒。豬肺炎支原體基因組中分散總共存在著688個這種基序。

2.4 P97和P102基因家族 由于支原體的基因組比較短,所以它的基因必須具有高度編碼能力,這樣才能使其具有一些必須功能。用BLASTCLUST分析,如果至少70%長度中有30%的氨基酸相似則定義為基因家族。豬肺炎支原體能夠粘附到豬呼吸道上皮黏膜纖毛上,是由于纖毛上存在Mhp粘附因子P97的特異性受體,而且基因分析表明,P97操縱元內(nèi)還存在一個編碼126 kDa的蛋白[6],命名為P102,這個蛋白的功能目前尚不清楚。對豬肺炎支原體進行BLASTP分析表明,P97和P102基因都存在基因家族。

2.5 脂蛋白 脂蛋白是支原體膜表面的主要成分[8],它們可能與支原體抗原變異性有關,而且可能是其功能結構。對豬肺炎支原體基因組進行基序分析,其上有53個ORFs可以與原核脂蛋白脂質(zhì)附著位點結合,這表明其基因組編碼容量為8.5%,其中只有3個ORFs(psgA,trsE以及ushA)具有功能,對于P46 ORF[9]和P65 ORF[10]前面都已經(jīng)研究過了。P65(mhp677)在蛋白質(zhì)水平上有兩個同源序列mhp539和mhp069。P46蛋白是一種具有種特異性的 Mhp膜蛋白。Futo[11]報道,P46基因(1257bp)中含有 3個 TGA和1個CGG密碼子。并且至少有1個 TGA編碼色氨酸[12],而 TGA在通用密碼子中為終止密碼子,CGG與通用密碼子一致編碼精氨酸[13]。P46基因前面沒有-35區(qū),這是Mhp所特有的。P65蛋白是一種脂蛋白,也是Mhp的主要免疫原蛋白,其免疫原區(qū)位于C端[14],它具有種特異性表位。

2.6 運輸?shù)鞍?豬肺炎支原體有一個蛋白質(zhì)家族具有磷酸轉移酶基序,包括sgaA(mhp386),sgaB(mhp387),sgaT(mhp571),mtlF(mhp567),mtlA(mhp569),nagE(mhp590)和licA(mhp042)等閱讀框。2.7 DNA復制和修復反應 豬肺炎支原體DNA聚合酶Ⅲ主要有α亞單位(polC,mhp549),α亞單位 2(dnaE,mhp599),β 亞單位(dnaN,mhp002),γtau亞單位(dnaX,mhp123),以及一個附加亞單位(mhp119),該亞單位是保守的,對其功能目前還不清楚。目前,已經(jīng)知道m(xù)hp598閱讀框具有DNA聚合酶I上的3′-5′核酸外切酶部分,但是豬肺炎支原體上沒有RNase H基因,因此目前還不清楚DNA復制過程中的岡崎片段是怎么移動的?豬肺炎支原體上的 DNA解旋酶[15],是由亞單位 A(gyrA,mhp545)和亞單位B(gyrB,mhp270)構成的。其引發(fā)體的成分主要有dnaG引發(fā)酶(mhp062)以及dna C脫氧核糖核酸解螺旋酶(mhp664)。

其基因組中有編碼拓撲異構酶的基因,這樣可以舒緩超級螺旋的張力。拓撲異構酶包括DNA拓撲異構酶Ⅰ(topA,mhp097)和拓撲異構酶Ⅳ,拓撲異構酶Ⅳ的成分有亞單位A(parC,mhp034)和B(parE,mhp035)。另外,和其他支原體一樣,豬肺炎支原體具有初級DNA修復和應激系統(tǒng)。

2.8 毒力因子 目前對豬肺炎支原體的毒力因子研究還不是特別清楚,但是P97作為粘附因子的功能已經(jīng)確定。依賴基序分析來預測潛在的毒力因子是一種必然趨勢,同時通過研究其他支原體和細菌的毒力因子來預測豬肺炎支原體的毒力因子也是一種策略,革蘭陽性菌的毒力與蛋白酶有關,豬肺炎支原體有5種帶有氨基肽酶標記的蛋白質(zhì),分別為(map[mhp209], pepA [mhp462],pepF[mhp520],pepP[mhp680]和 gcp[mhp656]),并且有兩種帶有絲氨酸蛋白酶標記的蛋白質(zhì),分別為(mhp287和 mhp292),還有一個 ClpB同系物(mhp278)?，F(xiàn)在認為其中一種或者多種蛋白酶參與纖毛粘附因子P97的翻譯后加工[16]。P97蛋白的氨基酸序列中只有一段疏水區(qū),即位于N末端的由17個氨基酸組成的疏水區(qū),是潛在的跨膜區(qū),主要的抗原區(qū)分布在C末端附近。在814～887個氨基酸(核酸序列的2 440～2 665)處有一段由5個氨基酸(V/EAAKP)組成的15個重復序列,即R1重復區(qū)。此外在靠近C末端的981～1 020個氨基酸(核酸序列的2 941～3 061)處有一段由10個氨基酸(GTPNQ GKKAE)組成的4個重復,即 R2重復區(qū)。

2.9 基因調(diào)節(jié) 和其他支原體一樣,豬肺炎支原體幾乎沒有控制基因表達的途徑。其基因組內(nèi)只有單個δ因子(rpoD,mhp063),沒有PROSITE araC,lysR,gntR,luxR和δ 54作用區(qū)域。在人型支原體,發(fā)酵支原體和關節(jié)炎支原體研究中發(fā)現(xiàn),一些短的腺嘌呤和胸腺嘧啶同聚束參與其脂蛋白位相轉化過程[17]。豬肺炎支原體和其他9種已測序的支原體中都有DnaK-DnaJ-GrpE伴侶分子復合物的成員,這些組分具有控制新生多肽鏈折疊的作用。豬肺炎支原體缺失了 Hsp60(GroEL)[18],對已報道序列(AJ251765)進行BLAST分析后更加證實了該結論,同時它還缺失了GroES,這表明其胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)折疊以及對折疊錯誤的蛋白質(zhì)的修復過程都是由DnaK-DnaJ-GrpR復合物完成的。mhp234(二硫鍵伴侶分子家族HSP33的成員之一);mhp278(具有伴侶蛋白活性的和 clpAB 2的 ATPase),以及mhp554,mhp656和mhp673(金屬依賴蛋白酶和假定分子伴侶)等都是假定伴侶分子。

豬肺炎支原體是第10個完成測序的支原體目成員,而且是惟一1個豬的支原體。從種系發(fā)育史上可以知道,它和肺支原體的關系最近,肺支原體是一種侵蝕性抗原。由于支原體目成員具有高度的趨異性,并且缺乏同線型,所以阻礙了對它們進行直接的比較研究,但是肺炎支原體和生殖支原體是例外,它們具有高度的相關性[19]。

總之,本文主要陳述了豬肺炎支原體基因組的一般特征,并且對其基因組結構進行了初步分析,為研究豬肺炎支原體的粘附機理奠定一定的基礎,從而促進對豬支原體肺炎的研究。

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