丘展鋒 黃國(guó)玉

建立替硝唑注射液無(wú)菌檢查方法，并對(duì)該法的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)試驗(yàn)確定了替硝唑注射液的無(wú)菌檢查方法。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑 虎紅瓊脂培養(yǎng)基;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基;改良馬丁液體培養(yǎng)基;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基;營(yíng)養(yǎng)肉湯;PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 高壓蒸汽滅菌鍋、天平、凈化間、凈化工作臺(tái)、恒溫生化培養(yǎng)箱、WJ-6集菌儀。

1.3 陽(yáng)性菌 枯草芽孢桿菌［CMCC(B)65301］;金黃色葡萄球菌［CMCC(B)］;白色念珠菌［CMCC(B)98001］;生孢梭菌［CMCC(B)64941］;黑曲霉［CMCC(B)98003］;銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］(菌種來(lái)源:中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)

1.4 供試品 替硝唑注射液，廣東慶發(fā)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備 取每種培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗8次，每次 100 ml。

2.2 陽(yáng)性對(duì)照菌的制備 文獻(xiàn)［1］取枯草芽孢桿菌;銅綠假單胞菌;金黃色葡萄球菌;生孢梭菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基)中35℃培養(yǎng)培養(yǎng)18 h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每1 ml中含菌數(shù)約為50～100 cfu的陽(yáng)性對(duì)照菌液備用;另取白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于改良馬丁液體培養(yǎng)基中，25℃ 下培養(yǎng)24 h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每1 ml中含菌數(shù)約為50～100 cfu的陽(yáng)性對(duì)照菌備用;取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5 ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，然后用0.9%氯化鈉溶液稀釋至每1 ml含菌數(shù)約為50～100cfu的陽(yáng)性對(duì)照菌備用。

2.3 檢查方法驗(yàn)證［2］依《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄ⅩⅢB“無(wú)菌檢查方法”中薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，加入枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞、生孢梭菌各1 ml傾注硫乙醇酸鹽硫體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)，30℃ ～35℃培養(yǎng)3～5 d;加入黑曲霉;白色念珠菌各1 ml，傾注改良馬丁培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)，23℃ ～28℃培養(yǎng)3～5 d。①陽(yáng)性對(duì)照組不加供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗。在最后一次沖洗液中加入“2.2.”項(xiàng)下的對(duì)照菌液枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、生孢梭菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌各1 ml，將硫乙醇酸鹽硫體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基分別加至濾筒內(nèi)培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果(見(jiàn)表1);②陰性對(duì)照 取“2.1.”項(xiàng)下制備的供試品，在最后一次沖洗后將硫乙醇酸鹽硫體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基分別加至濾筒內(nèi)培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果(見(jiàn)表1);③供試品試驗(yàn)組取“2.1.”項(xiàng)下制備的供試品，在最后一次沖洗液中加入“2.2.”項(xiàng)下的對(duì)照菌液枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、生孢梭菌、黑曲霉、銅綠假單胞菌各1 ml，將硫乙醇酸鹽硫體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基分別加至濾筒內(nèi)培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果(見(jiàn)表1)。以上各組每次試驗(yàn)平行2個(gè)濾筒。

表1 供試品試驗(yàn)組加入菌種后的結(jié)果

結(jié)果采用800 ml沖洗液時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組菌48 h內(nèi)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)，供試品試驗(yàn)組有菌生長(zhǎng)。

3 討論

根據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版二部用無(wú)菌薄膜過(guò)濾法對(duì)替硝唑注射液進(jìn)行無(wú)菌驗(yàn)證，從方法學(xué)結(jié)果可見(jiàn)，供試品試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，供試品試驗(yàn)組均有菌生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確，說(shuō)明所建無(wú)菌檢查方法可用于替硝唑注射質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典.2005年版.化工工業(yè)出版社.

［2］鄭鈞鏞，王光寶.藥品微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù).1989年版.人民衛(wèi)生出版社.