張先鋒 呂智 馮毅

骨肉瘤是一種常見(jiàn)于兒童和青少年的惡性骨腫瘤，呈高度侵襲性［1］。目前主要采用多種抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用治療，然而抗腫瘤藥物特殊的毒副作用和耐藥性限制其廣泛應(yīng)用。日前，許多學(xué)者已將研究方向轉(zhuǎn)向不良反應(yīng)較小的生物治療。本試驗(yàn)將INF-γ、DDP單用及聯(lián)用于體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞，觀察其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，為骨肉瘤的生物治療提供理論依據(jù)。通過(guò)觀察INF-γ與DDP聯(lián)合治療骨肉瘤的效應(yīng)以篩選出敏感的聯(lián)合用藥方案，為骨肉瘤綜合治療提供新手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞株(南京凱基生物科技有限公司)，10%小牛血清(杭州四季青公司)DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 重組人INF-γ(上?？寺「呖萍加邢薰?;順鉑(齊魯制藥有限公司);MTT(Sigma公司);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo公司);流式細(xì)胞儀(Benckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U-2OS細(xì)胞，4000細(xì)胞/孔接種于 96 孔板，24 h 后加 INF-γ(濃度 10、100、1000、10000 u/ml)和 DDP(濃度 5、10、15、20、25 μg/ml)，并設(shè)對(duì)照組。加藥48 h后每孔加MTT 20 ul，培養(yǎng)4 h后棄上清液，加150 ul DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度(A值)，測(cè)藥物單用及聯(lián)用對(duì)U-2OS細(xì)胞的抑制率，求半數(shù)抑制濃度(IC50值)。抑制率=(A對(duì)照組-A加藥組)/A對(duì)照組×100%。

聯(lián)合用藥效果判定:Q=E(A+B)/(EA+EB-EAxEB)，E(A+B)為兩藥合用抑制率，EA、EB為兩藥單用抑制率，Q＜0.85:兩藥作用拮抗，Q為0.85-1.15:兩藥作用相加，Q＞1.15:兩藥作用協(xié)同［2］。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束，收集約(1～5)×106個(gè)/ml細(xì)胞，500～1000 rpm離心，棄培養(yǎng)液。3mL PBS洗滌。離心去除PBS，加預(yù)冷70%乙醇固定，4℃，1～2 h。離心棄固定液，3 ml PBS重懸。400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次，500～1000 rpm離心，棄去PBS。用1mL PI染液染色，4℃避光。FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，Cell-Quest分析軟件測(cè)定細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

見(jiàn)圖1 ～2，表1、2、3。

圖1 不同濃度INF對(duì)U-20S細(xì)胞增殖抑制作用

圖2 不同濃度順鉑對(duì)U-20S細(xì)胞增殖抑制作用

表1 INF-γ聯(lián)合DDP同時(shí)給藥對(duì)U-2OS細(xì)胞增殖的抑制作用

表2 INF-γ聯(lián)合DDP序貫給藥對(duì)U-2OS細(xì)胞增殖的抑制情況

表3 INF-γ和DDP對(duì)人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞周期的影響

3 討論

手術(shù)切除腫塊、新輔助化療等是治療骨肉瘤最常用的方法，但效果卻并不佳，40%患者在積極治療過(guò)程中腫塊復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)治療方法不僅可能給患者帶來(lái)嚴(yán)重殘疾，而且毒副反應(yīng)嚴(yán)重，腫瘤耐藥性的出現(xiàn)是繼續(xù)有效化療陷入困境。因此，尋找一種可有效殺傷腫瘤細(xì)胞，又不產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，且在治療過(guò)程中很少產(chǎn)生耐藥性的治療方案，是骨肉瘤治療研究的方向。研究表明順鉑、異環(huán)磷酰胺等單用對(duì)骨肉瘤的有效率達(dá)到26% ～80%，聯(lián)合應(yīng)用有效率更高［3］。近年研究發(fā)現(xiàn)干擾素通過(guò)多種途徑直接發(fā)揮抗腫瘤作用，且可增強(qiáng)腫瘤對(duì)其他化療藥物的敏感性，減少毒副作用［4-8］。但I(xiàn)NF-γ聯(lián)合DDP對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。

目前順鉑被證實(shí)能損傷腫瘤細(xì)胞DNA，引起DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［9］。本研究證實(shí)DDP對(duì)人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，其生長(zhǎng)抑制作用與DDP濃度呈正相關(guān)(見(jiàn)圖2)。DDP體外對(duì)U-2OS細(xì)胞增殖抑制作用的 IC50 約3.2 μg/ml。DDP 濃度自20 μg/ml起，其生長(zhǎng)抑制作用進(jìn)入平臺(tái)期。

干擾素抗腫瘤作用以INF-γ最強(qiáng)，其機(jī)理可能有:①抑制腫瘤細(xì)胞分裂:INF作用細(xì)胞膜，刺激腺苷酸環(huán)化酶，使cAMP增加，抑制DNA的合成及細(xì)胞分裂，故有抗腫瘤作用;②調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體抗腫瘤免疫力:INF能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞及NK細(xì)胞的殺傷性，增加細(xì)胞表面抗原和受體的表達(dá)，抑制B細(xì)胞的功能，從而降低腫瘤細(xì)胞表面封閉抗體的水平［10］。因此我們考慮可能 INF-γ(≥1000 u/ml)和 DDP共同作用于腫瘤細(xì)胞DNA，從而發(fā)揮相加作用抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究證實(shí)DDP以25 μg/ml單用于U-2OS細(xì)胞48 h，增殖抑制率是 78.1%，而 DDP以 5 μg/ml與 1000 u/ml INF-γ聯(lián)合作用48 h，增殖抑制率是81.6%(見(jiàn)表1)。此結(jié)果顯示，INF-γ(≥1000 u/ml)和DDP聯(lián)用可使順鉑在小劑量時(shí)即有明顯細(xì)胞增殖抑制作用，從而避免大劑量應(yīng)用DDP引起的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)DDP作用24 h后再加INF-γ(≥1000 u/ml)作用24 h對(duì)U-2OS細(xì)胞的抑制率高于INF-γ作用24 h后再加DDP作用24h時(shí)的抑制率(見(jiàn)表2)，這為臨床用藥時(shí)間選擇提供了理論依據(jù)。

細(xì)胞持續(xù)增殖和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂是腫瘤細(xì)胞的基本特征之一［11］。腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中失去接觸抑制，周期檢控點(diǎn)功能喪失，無(wú)法調(diào)控抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，細(xì)胞持續(xù)分裂、不斷增殖，因此外源誘導(dǎo)物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，是判斷誘導(dǎo)物誘導(dǎo)分化能力的重要參考指標(biāo)［12］。本研究表明，經(jīng)過(guò)INF-γ、DDP單獨(dú)及聯(lián)合作用人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞，細(xì)胞周期中G0/G1占整個(gè)細(xì)胞周期比例逐漸增高，而與細(xì)胞生長(zhǎng)分裂關(guān)系較密切的S、G2/M期所占細(xì)胞周期比例則有明顯的降低，且聯(lián)合用藥降低的更明顯(見(jiàn)表5)?？紤]INF-γ、DDP可能作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)人骨肉瘤U-2OS分化，抑制細(xì)胞分裂增殖。

通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的觀察以及在體外試驗(yàn)單藥及聯(lián)合用藥情況，在不同藥物量效水平上定量分析各抗癌藥物之間的協(xié)同、相加和拮抗作用，可為骨肉瘤患者篩選出最敏感的聯(lián)合用藥方案，為臨床正確部署聯(lián)合化療方案提供可靠幫助。但I(xiàn)NF-γ和順鉑聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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