馬璇 劉琳 張蕊 劉吉東 沈衛(wèi)

糖尿病與機(jī)體內(nèi)自由基的增多以及抗氧化防御系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病各種并發(fā)癥的共同發(fā)病途徑[1]。藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，PC)是一種重要的色素蛋白，普遍存在于藍(lán)藻細(xì)胞中的光合輔助色素，由開鏈四吡咯化合物和脫輔蛋白通過硫鏈鍵結(jié)合，是螺旋藻(spiru lina)細(xì)胞中起重要光合作用的天然色素，在螺旋藻中的含量高達(dá)10%～20%[2]。研究表明，藻藍(lán)蛋白具有促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞的再生，清除自由基、抑制腫瘤、抗輻射、抗過敏、抗疲勞、抗病毒、增強(qiáng)免疫力和抗炎的作用[3]。目前，對(duì)藻藍(lán)蛋白的研究開發(fā)集中于抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)作用等方面，針對(duì)糖尿病治療作用及其機(jī)制鮮有研究，本實(shí)驗(yàn)利用2型糖尿病大鼠模型，觀察藻藍(lán)蛋白的抗氧化作用，探索其對(duì)2型糖尿病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

健康雄性W is t a r大鼠3 2只，鼠齡1個(gè)月，體重1 3 0 g～1 5 0 g，由青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK(魯)20030010)。動(dòng)物均于實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境一周，自由飲食，室溫(23±2)℃，自然光照，相對(duì)濕度50%～70%。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(8只)、模型組及藥物干預(yù)組(24只)。正常對(duì)照組大鼠喂以普通飼料，其余喂以高糖高脂飼料(15%豬油、20%蔗糖、13%蛋黃粉、2%膽酸鈉、50%普通飼料)飼養(yǎng)[4-5]，四周后禁食12h，以30mg/kg劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)檸檬酸緩沖液，正常對(duì)照組大鼠同步注射等量的檸檬酸緩沖液。注射1周后剪尾取血，測(cè)空腹血糖，以血糖值≥7.0mmol/L為糖尿病模型建立成功。24只大鼠造模成功，將其隨機(jī)分為模型組、藻藍(lán)蛋白組、二甲雙胍組各8只，其中模型組2只大鼠于實(shí)驗(yàn)第11周死亡。

1.2 干預(yù)措施

糖尿病模型成功后(實(shí)驗(yàn)第9周)開始干預(yù)治療。藻藍(lán)蛋白粉劑(藻藍(lán)蛋白由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供)暗室分裝后-20℃保存，用前加蒸餾水稀釋至濃度為10%的混懸液，按500m g/kg體重灌胃給藥(藻藍(lán)蛋白劑量由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所推薦使用)，每天1次，連續(xù)10天；二甲雙胍組同步給予二甲雙胍(400m g/kg)，以蒸餾水稀釋至8%濃度連續(xù)灌胃10天。正常對(duì)照組和糖尿病模型組同步給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃10天。

1.3 血糖

各組動(dòng)物分別在第1周末、第8周末、第10周末測(cè)空腹血糖(FBG)(mmol/L)。大鼠禁食12h后，次日早鼠尾靜脈取血，用血糖儀(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司，穩(wěn)豪型)測(cè)定空腹血糖。

1.4 免疫組化染色

治療結(jié)束后(11周初)，各組大鼠頸椎脫臼處死，迅速取胰腺，4℃生理鹽水沖洗干凈后10%甲醛固定24h，蒸餾水浸泡4h后。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA 2135石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5um，每隔20片取1片，每個(gè)標(biāo)本取6片，分別裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，室溫保存?zhèn)溆?。iNOS親和純化抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒，均由武漢博士德生物司提供。取上述切片常規(guī)脫蠟至水，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下特異性染色為片狀棕黃色粗顆粒。部分切片不加一抗以0.1mol/L PBS替代染色，不出現(xiàn)陽(yáng)性著色。光學(xué)顯微鏡(400倍)下，每張切片隨機(jī)選擇4個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)100個(gè)胰島細(xì)胞中iNOS的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以各組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示；組間比較用方差分析，q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

造模成功后，糖尿病大鼠體重較正常組明顯降低(P＜0.05)。經(jīng)過治療后，藻藍(lán)蛋白組和二甲雙胍組大鼠體重較模型組顯著增加(P＜0.05)，且兩組大鼠多飲、多食、多尿的情況有所改善，表明藻藍(lán)蛋白和二甲雙胍對(duì)糖尿病癥狀改善有一定的治療效果(表1)。

2.2 空腹血糖

STZ造模后，模型組、藻藍(lán)蛋白組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖與正常組比較明顯升高(P＜0.05)。經(jīng)干預(yù)治療后，藻藍(lán)蛋白組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)(表2)。

2.3 組織病理

正常組大鼠的胰島呈圓形或橢圓形的細(xì)胞團(tuán)，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞邊界清晰，排列整齊，分布均勻；糖尿病對(duì)照組大鼠的胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞邊界不清，排列紊亂；部分細(xì)胞腫脹、皺縮、壞死、核缺失；藻藍(lán)蛋白組和二甲雙胍組大鼠胰島細(xì)胞病變減輕，胰島細(xì)胞團(tuán)形狀較規(guī)則，與模型組有較大改善，但與正常組相比仍有差距(圖1)。

2.4 iNOS表達(dá)

正常組大鼠胰島細(xì)胞iNOS呈弱表達(dá)，糖尿病模型組大鼠(2只死亡)胰島細(xì)胞iNOS表達(dá)較正常組增強(qiáng)(P＜0.05)，呈棕黃色，著色部位主要在胰島細(xì)胞胞漿。藻藍(lán)蛋白組和二甲雙胍組大鼠胰島細(xì)胞iNOS表達(dá)較糖尿病組顯著降低(P＜0.05)，著色較淺，但藻藍(lán)蛋白組和二甲雙胍組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表3和圖2。

3 討論

Ceriello[6]等認(rèn)為，氧化應(yīng)激是胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病的共同發(fā)病機(jī)制，機(jī)體因遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多；清除能力降低，當(dāng)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織和功能損傷[7-8]。NO是具有許多生物活性的自由基，是重要的信使分子和效應(yīng)分子，但是其過量產(chǎn)生會(huì)發(fā)揮極強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。

在糖尿病早期，由于腎小球或視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO增多，加上糖尿病患者普遍存在的脂毒性，非飽和游離脂肪酸上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)，產(chǎn)生過量的NO，過量的NO產(chǎn)生大量的過硝酸根離子(ONOO-)和OH-等自由基，損傷β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[9]。同時(shí)，增高的NO促進(jìn)胰島素分泌，加之胰島素抵抗的加重及持續(xù)高血壓，刺激β細(xì)胞處于持續(xù)高分泌狀態(tài)，促進(jìn)β細(xì)胞衰退，更加重了糖尿病的進(jìn)展。另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在所有組織中胰島內(nèi)的具有抗氧化能力的超氧化物歧化酶(SOD)活性最低，胰島又是富含膜結(jié)構(gòu)的組織，極易受自由基的攻擊，以上特性使胰島細(xì)胞受NO產(chǎn)生的氧化損傷作用增強(qiáng)。一氧化氮合酶(NOS)抑制劑可明顯降低BB大鼠糖尿病的發(fā)病率，進(jìn)一步說明了NO在糖尿病中的重要作用。但是，由于NO半衰期極短，在組織中直接測(cè)定非常困難，Kolodziejska等[10]研究表明，在病理狀態(tài)下直接檢測(cè)組織中iNOS可客觀反映組織中NO的含量。

表1 各組動(dòng)物體重的變化(±s)(單位：g)

表1 各組動(dòng)物體重的變化(±s)(單位：g)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 例數(shù) 1周 造模后(8周) 治療后(10周)正常組 8 145.25±5.01 347.88±21.50 390.38±28.54模型組 8 146.75±4.56 269.00±23.77 264.00±24.33△藻藍(lán)蛋白組 8 145.50±3.96 261.00±17.70 287.38±13.38△二甲雙胍組 8 148.38±3.46 260.13±26.24 288.25±21.99△

表2 各組大鼠空腹血糖的比較(±s)(單位：mmol/L)

表2 各組大鼠空腹血糖的比較(±s)(單位：mmol/L)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 例數(shù) 劑量(mg/kg) 造模后(8周) 治療后(10周)正常組 8 — 3.48±0.50 3.91±0.71模型組 8 — 9.15±3.20* 8.94±1.90*藻藍(lán)蛋白組 8 500 9.75±1.58* 7.05±0.87△二甲雙胍組 8 400 9.88±2.06* 5.74±1.32△

表3 各組不同臟器iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

表3 各組不同臟器iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 N 胰腺正常組 8 3.75±1.26模型組 6 18.00±1.63藻藍(lán)蛋白組 8 8.00±1.63 △二甲雙胍組 8 10.50±2.52 △

圖1 大鼠胰腺細(xì)胞，HE×200

二甲雙胍具有抗氧化特性，在大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，二甲雙胍可以通過降低NAD(P)H氧化酶或線粒體呼吸鏈的活性而減少ROS產(chǎn)生[11]。Romay等[12]研究表明，藻藍(lán)蛋白可以清除烷基、羥基、過氧基，可以抑制由Fe2+、壞血酸致微粒體脂質(zhì)過氧化，其抗氧化作用與抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)及NO產(chǎn)生有關(guān)。Bhat等[13]認(rèn)為，藻藍(lán)蛋白還可以清除ONOO-，且其清除氧自由基作用與其發(fā)色團(tuán)有關(guān)。

圖2 大鼠胰島細(xì)胞iNOS表達(dá)，DAB×400

本實(shí)驗(yàn)表明，糖尿病大鼠模型成功后血糖明顯升高。經(jīng)過兩周治療，藻藍(lán)蛋白組和二甲雙胍組血糖均有所下降，二甲雙胍組、藻藍(lán)蛋白組與模型組相比同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明藻藍(lán)蛋白具有降低血糖的作用。另外，本實(shí)驗(yàn)研究證明，經(jīng)藻藍(lán)蛋白治療后的糖尿病大鼠胰島細(xì)胞中的iNOS表達(dá)，無論是著色程度還是陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量上較模型組都明顯呈現(xiàn)弱表達(dá)，著色部分主要位于胞漿。結(jié)合藻藍(lán)蛋白干預(yù)組與模型組病理形態(tài)學(xué)對(duì)比，推測(cè)，藻藍(lán)蛋白很可能從抗氧化方面具有一定的治療2型糖尿病的作用。Bottino等[14]通過分離純化胰島細(xì)胞，在體外早期應(yīng)用抗氧化劑干預(yù)胰島細(xì)胞，也發(fā)現(xiàn)阻斷氧化應(yīng)激的反應(yīng)過程可明顯降低胰島細(xì)胞的損傷，并可促進(jìn)胰島細(xì)胞的增殖，為2型糖尿病的早期診斷和干預(yù)提供了一種新的思路。另外，二甲雙胍與藻藍(lán)蛋白均具有降糖、抑制iNOS表達(dá)、改善胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用，但藻藍(lán)蛋白作用靶點(diǎn)是否與二甲雙胍一致，其確切的作用機(jī)制尚需探索。藻藍(lán)蛋白有望成為治療2型糖尿病的候選藥物，其具體的作用機(jī)制、劑量、療程有待進(jìn)一步研究。

[1]金雷,薛宏宇,金禮吉,等.抗氧化劑在糖尿病中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,8(2):383-384.

[2]陳志桃,王立興,林維欽,等.螺旋藻藻藍(lán)蛋白的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2003,6(15):1-5.

[3]Bani-Sadr F,Teissiere F,Curie I,et al.Anti-infection prophylaxis after sexual assault.Experience of the Raymond Poincare-Garches Hospital[J].Presse Med,2001,30(6):253-258.

[4]郭嘯華,劉志紅,李恒,等.高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型及其腎病特點(diǎn)[J].中國(guó)糖尿病雜志,2002,10(5):290-294.

[5]李愛卿,王志慧,趙躍斌.高糖高脂飼料誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型[J].臨床醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,l14(2):130.

[6]Ceriello A,Motz E.Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance,diabetes,and cardiovascular disease?The common soil hypothesis revisited[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(5):816-823.

[7]Mircescu G.Oxidative stress:an accomplice to uremic toxicity?[J].J Ren Nutr,2006,16(3):194-198.

[8]Lushchak VI.Free radical oxidation of proteins and its relationship with functional state of organisms[J].Biochemistry(Mosc),2007,72(8):809-827.

[9]Kr ncke KD,Fehsel K,Kolb-Bachofen V.Nit ric ox ide cytotoxicity versus cytoprotection—how,why,when,and where?[J].Nitric Oxide,1997,1(2):107-120.

[10]Kolodziejska KE,Burns AR,Moore RH,et al.Regulation of inducible nitric oxide synthase by aggresome formation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(13):4854-4859.

[11]Ouslimani N,Peynet J,Bonnefont-Rousselot D,et al.Metformin decreases intracellular production of reactive oxygen species in aortic endothelial cells[J].Metabolism,2005,54(6):829-834.

[12]Romay Ch,González R,Ledón N,et al.C-phycocyanin:a biliprotein with antioxidant,anti-inflammatory and neuroprotective effects[J].Curr Protein Pept Sci,2003,4(3):207-216.

[13]Bhat VB,Madyastha KM.Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobilin from Spirulina platensis:protection against oxidative damage to DNA[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,285(2):262-266.

[14]Bottino R,Balamurugan AN,Tse H.et al.Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment[J].Diabetes,2004,53(10):2559-2568.