謝麗基,謝芝勛,龐耀珊,劉加波,鄧顯文,謝志勤

(廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001)

貝類(lèi)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)二重PCR檢測(cè)方法的建立*

謝麗基,謝芝勛*,龐耀珊,劉加波,鄧顯文,謝志勤

(廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001)

根據(jù)基因庫(kù)中單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的基因序列,分別設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物,通過(guò)對(duì)二重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化,研究建立了可同時(shí)檢測(cè)鑒別這2種原蟲(chóng)的二重PCR。對(duì)同一樣品中的單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到2條大小與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的244 bp(單孢子蟲(chóng))和478 bp(折光馬爾太蟲(chóng))的特異性擴(kuò)增帶,而對(duì)派琴蟲(chóng)、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌等病原體的檢測(cè),結(jié)果均為陰性。敏感性試驗(yàn)表明,該技術(shù)最低能檢測(cè)到10 pg的單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)DNA。

單孢子蟲(chóng);折光馬爾太蟲(chóng);二重PCR

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴(kuò)大及養(yǎng)殖密度的增高,貝類(lèi)的病害也頻繁出現(xiàn)。目前,危害最嚴(yán)重的貝類(lèi)原蟲(chóng)有單孢子蟲(chóng)(Haplosporidiumspp.)和折光馬爾太蟲(chóng)(Marteilia ref ringens)。單孢子蟲(chóng)主要感染血細(xì)胞,結(jié)締組織和消化道上皮,可引起較高的死亡率[1-2]。馬爾太蟲(chóng)可引起貝類(lèi)消瘦,消化道變色,停止生長(zhǎng)并死亡[3-4]。

單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有電鏡觀察、組織細(xì)胞學(xué)檢查和原位雜交等。這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,缺乏專(zhuān)一性,在實(shí)際工作中具有一定的局限性[5-9]。病原檢測(cè)、篩選建立無(wú)特定病原體的健康群,仍然是目前預(yù)防與控制這些原蟲(chóng)病的最有效辦法。PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),已成為動(dòng)物病原檢測(cè)的重要方法。至今仍未見(jiàn)有應(yīng)用二重PCR技術(shù)對(duì)貝類(lèi)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)和診斷的報(bào)道。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)2對(duì)引物,建立了單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的二重PCR快速檢測(cè)技術(shù),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和DNA 嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物病原庫(kù);折光馬爾太蟲(chóng)、派琴蟲(chóng)、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌等由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所生物技術(shù)室提供;尼氏單孢子蟲(chóng)、沿岸單孢子蟲(chóng)的DNA由美國(guó)維吉尼亞海洋科學(xué)研究所的Stokes N贈(zèng)送。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR儀為美國(guó)Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。PCR試劑盒及PMD18-T試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DNA片段回收試劑盒購(gòu)自BioDev公司;海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的基因保守序列,通過(guò)Blast驗(yàn)證,設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物(表1)。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 The primers used in the study

1.2.2 核酸抽提 取待檢貝類(lèi)的心臟、鰓、消化腺組織等共約100 mg,勻漿后根據(jù)海洋組織DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的提取。參照Sambrook方法測(cè)定核酸的濃度和純度[10],保存于-20℃?zhèn)溆?。?duì)照病原DNA的抽提按同樣方法進(jìn)行。

1.2.3 PCR擴(kuò)增介質(zhì)及PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化100 μ L 的反應(yīng)體系中含 :25 mmol/L MgCl25 μ L,10 ×PCR buffer10 μ L,10mmol/L dNTP 2 μ L,Taq聚合酶(5 U)0.5 μ L,適當(dāng)濃度的上游引物和下游引物,模板各5 μ L。以抽提的DNA為模板,對(duì)PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化,以確定最佳的PCR模式。

1.2.4 PCR特異性試驗(yàn) 將提取的折光馬爾太蟲(chóng)、單孢子蟲(chóng)、派琴蟲(chóng)、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌的DNA分別加入到多重PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)其特異性。

1.2.5 PCR的敏感性 測(cè)定單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)模板的DNA含量后,按10倍遞增稀釋,同時(shí)加入到最佳的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)其敏感性。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測(cè)序 取50 μ L PCR產(chǎn)物分別與5 μ L溴酚蘭混合,在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后,在紫外光下觀察拍照,與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量作比較,分析并記錄結(jié)果。在紫外燈下用刀片切割所需的片段,然后用凝膠回收試劑盒純化回收。取適量純化回收的PCR產(chǎn)物,與PMD18-T于16℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌。挑取在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的白色菌落,37℃培養(yǎng),用堿裂解法抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè),陽(yáng)性克隆菌送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 利用建立的貝類(lèi)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)二重PCR方法,對(duì)美國(guó)維吉尼亞海洋科學(xué)研究所的Stokes N贈(zèng)與的尼氏單孢子蟲(chóng)、沿岸單孢子蟲(chóng)的DNA進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用建立的方法對(duì)廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR條件優(yōu)化

通過(guò)對(duì)PCR的引物濃度、反應(yīng)溫度、時(shí)間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化,最后確定 PCR 中Haplosporidium7和Haplosporidium8引物的最佳工作終濃度為 0.3 μ mol/L,Marteilia1和Marteilia2引物的最佳工作終濃度為0.4 μ mol/L,PCR的最佳反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃1 min,57℃1 min,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);再經(jīng)72℃10 min后。

2.2 PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用建立的PCR方法對(duì)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)DNA,以及對(duì)照病原(派琴蟲(chóng)、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果含有單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)核酸模板的樣品分別能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的244 bp和478 bp的條帶;而其他對(duì)照菌株DNA無(wú)任何擴(kuò)增條帶(圖1)。

圖1 PCR特異性試驗(yàn)Fig.1 The specificity assay of PCR

2.3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)敏感性測(cè)定,該P(yáng)CR最低能檢出10 pg單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的DNA模板(圖2)。

圖2 敏感性試驗(yàn)Fig.2 The sensitivity assay of PCR

2.4 測(cè)序結(jié)果與序列分析

經(jīng)測(cè)序分析及Blast比對(duì)分析,證明了單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為244 bp和478 bp,與設(shè)計(jì)大小相符。PCR產(chǎn)物的核酸序列與引物設(shè)計(jì)模板的基因?qū)?yīng)片段的同源性一致。

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

建立的方法對(duì)尼氏單孢子蟲(chóng)和沿岸單孢子蟲(chóng)DNA的檢測(cè)均為陽(yáng)性。對(duì)廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果檢出2份折光馬爾太蟲(chóng)陽(yáng)性,陽(yáng)性率為1.68%,未檢出單孢子蟲(chóng)。

3 討論

單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)是危害海水養(yǎng)殖貝類(lèi)的重要病原體,在歐洲、美洲和大洋洲等國(guó)家的感染普遍存在[11-17]。我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)了多種海洋貝類(lèi)作為貝種用于海水養(yǎng)殖,但在進(jìn)口過(guò)程中都沒(méi)有進(jìn)行單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)感染的檢測(cè),單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)可能會(huì)隨著貝類(lèi)的引進(jìn)而進(jìn)入我國(guó),并在不同貝類(lèi)間傳播。因此,迫切需要建立一種快速敏感的單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)檢測(cè)方法。目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)這兩種原蟲(chóng)的方法有組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法、電鏡檢測(cè)法和原位雜交法,但這些方法操作繁瑣費(fèi)時(shí),在實(shí)際工作應(yīng)用中存在一定的局限性。

PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù),由于多重PCR反應(yīng)體系中存在2種以上的引物和模板,反應(yīng)過(guò)程中相互之間會(huì)有一定的影響,而且反應(yīng)總是有利于較小片段擴(kuò)增的原則,為使多重PCR中各片段都得到最佳擴(kuò)增,應(yīng)盡可能使各擴(kuò)增片段之間大小不要相差太懸殊,各引物所需擴(kuò)增條件接近一致,特別是各引物退火條件應(yīng)盡可能相同,最終確保2種擴(kuò)增產(chǎn)物量相對(duì)平衡。本試驗(yàn)中,根據(jù)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物,從而達(dá)到一次二重PCR擴(kuò)增,就可檢測(cè)并鑒別單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)。由于單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)在臨床上可能會(huì)出現(xiàn)混合感染,單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)二重PCR方法的建立就很有意義;通過(guò)對(duì)引物用量和PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化,單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)2種引物的最佳工作濃度分別為0.3 μ mol/L 和 0.4 μ mol/L,說(shuō)明了要使二重 PCR反應(yīng)體系中每一目的片段都得到最佳擴(kuò)增結(jié)果,適當(dāng)?shù)囊餄舛仁鞘种匾摹?/p>

本研究建立的單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)二重PCR方法全程(包括核酸提取、PCR擴(kuò)增)僅需約5 h,最低能同時(shí)檢出10 pg單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的DNA模板,這說(shuō)明該二重PCR與常規(guī)PCR一樣,都具有很高的敏感性,可以同時(shí)進(jìn)行單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的檢測(cè)和鑒別,這對(duì)于在貝類(lèi)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果,切斷其傳播途徑有重要意義,同時(shí)這也是有效防控以上貝類(lèi)原蟲(chóng)病,選育建立無(wú)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)病的健康貝類(lèi)養(yǎng)殖群所必要的。

牡蠣是中國(guó)南方沿海養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)貝類(lèi),也是中國(guó)傳統(tǒng)的出口海產(chǎn)品。因此,本研究應(yīng)用所建立的二重PCR技術(shù),對(duì)取自廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)折光馬爾太蟲(chóng)的感染率為1.68%,表明在廣西沿海地區(qū)養(yǎng)殖貝類(lèi)中存在折光馬爾太蟲(chóng)的感染。單孢子蟲(chóng)的感染在歐洲和美洲國(guó)家的感染普遍存在[14-17],該方法對(duì)單孢子蟲(chóng)和折光馬爾太蟲(chóng)的檢測(cè)具有相同的敏感性,而廣西沿海的119份牡蠣樣品未檢出單孢子蟲(chóng),提示需要進(jìn)行更多臨床樣品的檢測(cè)。

[1]Hine P M,Thorne T.Haplosporidiumsp.(Alveolata:Haplosporidia)associated with mortalities among rock oy stersSaccostrea cuccullatain north Western Australia[J].Dis Aquat Organ,2002,51(2):123-133.

[2]Ulrich P N,Ewart J W,Marsh A G.Prevalence ofPerkinsus marinus(dermo),Haplosporidium nelsoni(MSX),and QPX in bivalves of Delaware's inland bays and quantitative,highthroughput diagnosis of dermo by QPCR[J].J Eukaryot Microbiol,2007,54(6):520-526.

[3]Audemard C,Barnaud A,Collins C M,et al.Claire ponds as an experimental model forMarteilia re f ringenslife-cycle studies:new perspectives[J].J Exp M ar Bio Ecol,2001,257(1):87-108.

[4]Itoh N,Momoyama K,Ogawa K.First report of three protozoan parasites(a haplosporidian,Marteiliasp.andMarteilioidessp.)from theManila clam,Venerupis(=Ruditapes)philippinarum in Japan[J].J Invertebr Pathol,2005,88(3):201-206.

[5]Perkins F O.Electron microscope studies of sporulation in the oyster pathogenMinchinia costalis(Sporozoa:Haplosporida)[J].J Parasitol,1969,55:897-920.

[6]Stokes N A,Burreson E M.A sensitive and specific DN A probe for the oyster pathogenHaplosporidum nelsoni[J].J Euk Microbiol,1995,42:350-357.

[7]Lopez-Flores I,Robles F,Valencia J M,et al.Detection ofMarteilia re fringensusing nested PCR and in situ hybridisation inChamelea gallinafrom the Balearic Islands(Spain)[J].Dis Aquat Organ,2008,82(1):79-87.

[8]Carrasco N,Arzul I,Berthe F C,et al.In situ hybridization detection of initial infective stages ofMarteilia re fringens(Paramy xea)in its hostMytilus galloprovincialis[J].J Fish Dis,2008,31(2):153-157.

[9]K leeman S N,Le Roux F,Berthe F,et al.Specificity of PCR and in situ hybridization assays designed for detection ofMarteilia sy dneyiandM.re fringens[J].Parasitology,2002,125(Pt2):131-141.

[10]Sambrook J,Fritsh E T,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manuel[M].New York:Cold Spring Harbor.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.

[11]Audemard C,Sajus M C,Barnaud A,et al.Infection dy namics ofMarteilia ref ringensin flat oy sterOstrea edulisand copepodParacartia graniin a claire pond of Marennes-Olon Bay[J].Dis Aquat Organ,2004,61(1-2):103-111.

[12]Lopez-Flores I,Garrido-Ramos M A,Herran R la,et al.I-dentification ofMarteilia ref ringensinfecting the razor clamSolen marginatusby PCR and in situ hybridization[J].M ol Cell Probes,2008,22(3):151-155.

[13]Carrasco N,Lopez-Flores I,Alcaraz M,et al.Dynamics of the parasiteMarteiliaref ringens(Paramyxea)inMytilus galloprov incialisand zooplankton populations in Alfacs Bay(Catalonia,Spain)[J].Parasitology,2007,134(Pt 11):1541-1550.

[14]Russell S,Frasca S J,Sunila I,et al.Application of a multiplex PCR fo r the detection of protozoan pathogens of the eastern oysterCrassostrea virginicain field samples[J].Dis Aquat Org,2004,59:85-91.

[15]Haskin H H,Stauber L A,M ackin J A.Minchinia nelsonin.sp.(Haplosporidia,Haplosporidiidae):causative agent of the Delaware Bay oyster epizootic[J].Science,1966,153:1414-1416.

[16]Barber B J,Langan R,Howell T L.Haplosporidiumnelsoni(MSX)epizootic in the Piscataqua River Estuary(Maine/New Hampshire,USA)[J].J Parasitol,1997,83:148-150.

[17]Sunila I,Karolus J,Volk J.A new epizootic ofHaplosporidia(MSX),a haplospo ridian oyster parasite,in Long Island Sound[J].J Shellfish Res,1999,18:169-174.

Development of a Duplex PCR Assay for Detection ofHaplosporidiumandMarteilia ref ringensin Shellfish

XIE Li-ji,XIE Zhi-xun,PANG Yao-shan,LIU Jia-bo,DENG Xian-wen,XIE Zhi-qin

(Guang xi Veterinary Research Institute,N anning,Guang xi,530001,China)

A duplex polymerase chain reaction was optimized to simultaneously detect two pathogens,Haplosporidiumsp.andMarteilia ref ringensin shellfish.Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions on the sequences ofHaplosporidiumsp.andMarteilia ref ringensin Gen-Bank.All samples containingHaplosporidiumsp.andMarteilia ref ringenscould be amplified into two specific bands,244 bp forHaplosporidiumsp.and 478 bp forMarteilia ref ringensby this duplex PCR,but no specific bands of the same sizes were amplified from other shellfish pathogens,such asPerkinsussp.,Aeromonas hydrophila,Pseudomonas f luorescens,Vibrio parahaemolyticu,Vibrio alginolyticu,Vibrio f luvialisandVibrio mimicus.As little as 10 pg ofHaplosporidiumsp.andMarteilia ref ringensDNA could be detected.

Haplosporidiumsp.;Marteilia ref ringens;duplex PCR

S852.723

A

1007-5038(2010)01-0054-04

2009-07-25

國(guó)家百千萬(wàn)人才工程人選專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(945200603);廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻0630001-3M)

謝麗基(1981-),女,廣西靈山人,碩士,主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究。*通訊作者