謝麗基,謝芝勛,龐耀珊,劉加波,鄧顯文,謝志勤

(廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001)

貝類單孢子蟲和折光馬爾太蟲二重PCR檢測方法的建立*

謝麗基,謝芝勛*,龐耀珊,劉加波,鄧顯文,謝志勤

(廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001)

根據(jù)基因庫中單孢子蟲和折光馬爾太蟲的基因序列,分別設(shè)計了2對特異性引物,通過對二重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化,研究建立了可同時檢測鑒別這2種原蟲的二重PCR。對同一樣品中的單孢子蟲和折光馬爾太蟲模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到2條大小與試驗設(shè)計相符的244 bp(單孢子蟲)和478 bp(折光馬爾太蟲)的特異性擴(kuò)增帶,而對派琴蟲、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌等病原體的檢測,結(jié)果均為陰性。敏感性試驗表明,該技術(shù)最低能檢測到10 pg的單孢子蟲和折光馬爾太蟲DNA。

單孢子蟲;折光馬爾太蟲;二重PCR

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴(kuò)大及養(yǎng)殖密度的增高,貝類的病害也頻繁出現(xiàn)。目前,危害最嚴(yán)重的貝類原蟲有單孢子蟲(Haplosporidiumspp.)和折光馬爾太蟲(Marteilia ref ringens)。單孢子蟲主要感染血細(xì)胞,結(jié)締組織和消化道上皮,可引起較高的死亡率[1-2]。馬爾太蟲可引起貝類消瘦,消化道變色,停止生長并死亡[3-4]。

單孢子蟲和折光馬爾太蟲的傳統(tǒng)檢測方法有電鏡觀察、組織細(xì)胞學(xué)檢查和原位雜交等。這些方法費時費力,缺乏專一性,在實際工作中具有一定的局限性[5-9]。病原檢測、篩選建立無特定病原體的健康群,仍然是目前預(yù)防與控制這些原蟲病的最有效辦法。PCR方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點,已成為動物病原檢測的重要方法。至今仍未見有應(yīng)用二重PCR技術(shù)對貝類單孢子蟲和折光馬爾太蟲進(jìn)行檢測和診斷的報道。本試驗設(shè)計2對引物,建立了單孢子蟲和折光馬爾太蟲的二重PCR快速檢測技術(shù),現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和DNA 嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌均購自中國農(nóng)業(yè)部動植物病原庫;折光馬爾太蟲、派琴蟲、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌等由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所生物技術(shù)室提供;尼氏單孢子蟲、沿岸單孢子蟲的DNA由美國維吉尼亞海洋科學(xué)研究所的Stokes N贈送。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR儀為美國Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。PCR試劑盒及PMD18-T試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA片段回收試劑盒購自BioDev公司;海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒購自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)單孢子蟲和折光馬爾太蟲的基因保守序列,通過Blast驗證,設(shè)計了2對特異性引物(表1)。

表1 試驗所用引物序列Table 1 The primers used in the study

1.2.2 核酸抽提 取待檢貝類的心臟、鰓、消化腺組織等共約100 mg,勻漿后根據(jù)海洋組織DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行DNA的提取。參照Sambrook方法測定核酸的濃度和純度[10],保存于-20℃?zhèn)溆?。對照病原DNA的抽提按同樣方法進(jìn)行。

1.2.3 PCR擴(kuò)增介質(zhì)及PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化100 μ L 的反應(yīng)體系中含 :25 mmol/L MgCl25 μ L,10 ×PCR buffer10 μ L,10mmol/L dNTP 2 μ L,Taq聚合酶(5 U)0.5 μ L,適當(dāng)濃度的上游引物和下游引物,模板各5 μ L。以抽提的DNA為模板,對PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化,以確定最佳的PCR模式。

1.2.4 PCR特異性試驗 將提取的折光馬爾太蟲、單孢子蟲、派琴蟲、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌的DNA分別加入到多重PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增,檢測其特異性。

1.2.5 PCR的敏感性 測定單孢子蟲和折光馬爾太蟲模板的DNA含量后,按10倍遞增稀釋,同時加入到最佳的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增,檢測其敏感性。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測序 取50 μ L PCR產(chǎn)物分別與5 μ L溴酚蘭混合,在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后,在紫外光下觀察拍照,與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量作比較,分析并記錄結(jié)果。在紫外燈下用刀片切割所需的片段,然后用凝膠回收試劑盒純化回收。取適量純化回收的PCR產(chǎn)物,與PMD18-T于16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌。挑取在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上長出的白色菌落,37℃培養(yǎng),用堿裂解法抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測,陽性克隆菌送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對分析。

1.2.7 臨床樣品檢測 利用建立的貝類單孢子蟲和折光馬爾太蟲二重PCR方法,對美國維吉尼亞海洋科學(xué)研究所的Stokes N贈與的尼氏單孢子蟲、沿岸單孢子蟲的DNA進(jìn)行檢測。同時用建立的方法對廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR條件優(yōu)化

通過對PCR的引物濃度、反應(yīng)溫度、時間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化,最后確定 PCR 中Haplosporidium7和Haplosporidium8引物的最佳工作終濃度為 0.3 μ mol/L,Marteilia1和Marteilia2引物的最佳工作終濃度為0.4 μ mol/L,PCR的最佳反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃1 min,57℃1 min,72℃ 1 min,35個循環(huán);再經(jīng)72℃10 min后。

2.2 PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用建立的PCR方法對單孢子蟲和折光馬爾太蟲DNA,以及對照病原(派琴蟲、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和擬態(tài)弧菌)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果含有單孢子蟲和折光馬爾太蟲核酸模板的樣品分別能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的244 bp和478 bp的條帶;而其他對照菌株DNA無任何擴(kuò)增條帶(圖1)。

圖1 PCR特異性試驗Fig.1 The specificity assay of PCR

2.3 PCR敏感性試驗結(jié)果

經(jīng)敏感性測定,該PCR最低能檢出10 pg單孢子蟲和折光馬爾太蟲的DNA模板(圖2)。

圖2 敏感性試驗Fig.2 The sensitivity assay of PCR

2.4 測序結(jié)果與序列分析

經(jīng)測序分析及Blast比對分析,證明了單孢子蟲和折光馬爾太蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為244 bp和478 bp,與設(shè)計大小相符。PCR產(chǎn)物的核酸序列與引物設(shè)計模板的基因?qū)?yīng)片段的同源性一致。

2.5 臨床樣品的檢測

建立的方法對尼氏單孢子蟲和沿岸單孢子蟲DNA的檢測均為陽性。對廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果檢出2份折光馬爾太蟲陽性,陽性率為1.68%,未檢出單孢子蟲。

3 討論

單孢子蟲和折光馬爾太蟲是危害海水養(yǎng)殖貝類的重要病原體,在歐洲、美洲和大洋洲等國家的感染普遍存在[11-17]。我國從國外引進(jìn)了多種海洋貝類作為貝種用于海水養(yǎng)殖,但在進(jìn)口過程中都沒有進(jìn)行單孢子蟲和折光馬爾太蟲感染的檢測,單孢子蟲和折光馬爾太蟲可能會隨著貝類的引進(jìn)而進(jìn)入我國,并在不同貝類間傳播。因此,迫切需要建立一種快速敏感的單孢子蟲和折光馬爾太蟲檢測方法。目前國內(nèi)檢測這兩種原蟲的方法有組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢測法、電鏡檢測法和原位雜交法,但這些方法操作繁瑣費時,在實際工作應(yīng)用中存在一定的局限性。

PCR方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點。多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù),由于多重PCR反應(yīng)體系中存在2種以上的引物和模板,反應(yīng)過程中相互之間會有一定的影響,而且反應(yīng)總是有利于較小片段擴(kuò)增的原則,為使多重PCR中各片段都得到最佳擴(kuò)增,應(yīng)盡可能使各擴(kuò)增片段之間大小不要相差太懸殊,各引物所需擴(kuò)增條件接近一致,特別是各引物退火條件應(yīng)盡可能相同,最終確保2種擴(kuò)增產(chǎn)物量相對平衡。本試驗中,根據(jù)單孢子蟲和折光馬爾太蟲的基因序列設(shè)計出特異性引物,從而達(dá)到一次二重PCR擴(kuò)增,就可檢測并鑒別單孢子蟲和折光馬爾太蟲。由于單孢子蟲和折光馬爾太蟲在臨床上可能會出現(xiàn)混合感染,單孢子蟲和折光馬爾太蟲二重PCR方法的建立就很有意義;通過對引物用量和PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化,單孢子蟲和折光馬爾太蟲2種引物的最佳工作濃度分別為0.3 μ mol/L 和 0.4 μ mol/L,說明了要使二重 PCR反應(yīng)體系中每一目的片段都得到最佳擴(kuò)增結(jié)果,適當(dāng)?shù)囊餄舛仁鞘种匾摹?/p>

本研究建立的單孢子蟲和折光馬爾太蟲二重PCR方法全程(包括核酸提取、PCR擴(kuò)增)僅需約5 h,最低能同時檢出10 pg單孢子蟲和折光馬爾太蟲的DNA模板,這說明該二重PCR與常規(guī)PCR一樣,都具有很高的敏感性,可以同時進(jìn)行單孢子蟲和折光馬爾太蟲的檢測和鑒別,這對于在貝類單孢子蟲和折光馬爾太蟲的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果,切斷其傳播途徑有重要意義,同時這也是有效防控以上貝類原蟲病,選育建立無單孢子蟲和折光馬爾太蟲病的健康貝類養(yǎng)殖群所必要的。

牡蠣是中國南方沿海養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)貝類,也是中國傳統(tǒng)的出口海產(chǎn)品。因此,本研究應(yīng)用所建立的二重PCR技術(shù),對取自廣西沿海的119份牡蠣樣品進(jìn)行檢測,檢測折光馬爾太蟲的感染率為1.68%,表明在廣西沿海地區(qū)養(yǎng)殖貝類中存在折光馬爾太蟲的感染。單孢子蟲的感染在歐洲和美洲國家的感染普遍存在[14-17],該方法對單孢子蟲和折光馬爾太蟲的檢測具有相同的敏感性,而廣西沿海的119份牡蠣樣品未檢出單孢子蟲,提示需要進(jìn)行更多臨床樣品的檢測。

[1]Hine P M,Thorne T.Haplosporidiumsp.(Alveolata:Haplosporidia)associated with mortalities among rock oy stersSaccostrea cuccullatain north Western Australia[J].Dis Aquat Organ,2002,51(2):123-133.

[2]Ulrich P N,Ewart J W,Marsh A G.Prevalence ofPerkinsus marinus(dermo),Haplosporidium nelsoni(MSX),and QPX in bivalves of Delaware's inland bays and quantitative,highthroughput diagnosis of dermo by QPCR[J].J Eukaryot Microbiol,2007,54(6):520-526.

[3]Audemard C,Barnaud A,Collins C M,et al.Claire ponds as an experimental model forMarteilia re f ringenslife-cycle studies:new perspectives[J].J Exp M ar Bio Ecol,2001,257(1):87-108.

[4]Itoh N,Momoyama K,Ogawa K.First report of three protozoan parasites(a haplosporidian,Marteiliasp.andMarteilioidessp.)from theManila clam,Venerupis(=Ruditapes)philippinarum in Japan[J].J Invertebr Pathol,2005,88(3):201-206.

[5]Perkins F O.Electron microscope studies of sporulation in the oyster pathogenMinchinia costalis(Sporozoa:Haplosporida)[J].J Parasitol,1969,55:897-920.

[6]Stokes N A,Burreson E M.A sensitive and specific DN A probe for the oyster pathogenHaplosporidum nelsoni[J].J Euk Microbiol,1995,42:350-357.

[7]Lopez-Flores I,Robles F,Valencia J M,et al.Detection ofMarteilia re fringensusing nested PCR and in situ hybridisation inChamelea gallinafrom the Balearic Islands(Spain)[J].Dis Aquat Organ,2008,82(1):79-87.

[8]Carrasco N,Arzul I,Berthe F C,et al.In situ hybridization detection of initial infective stages ofMarteilia re fringens(Paramy xea)in its hostMytilus galloprovincialis[J].J Fish Dis,2008,31(2):153-157.

[9]K leeman S N,Le Roux F,Berthe F,et al.Specificity of PCR and in situ hybridization assays designed for detection ofMarteilia sy dneyiandM.re fringens[J].Parasitology,2002,125(Pt2):131-141.

[10]Sambrook J,Fritsh E T,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manuel[M].New York:Cold Spring Harbor.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.

[11]Audemard C,Sajus M C,Barnaud A,et al.Infection dy namics ofMarteilia ref ringensin flat oy sterOstrea edulisand copepodParacartia graniin a claire pond of Marennes-Olon Bay[J].Dis Aquat Organ,2004,61(1-2):103-111.

[12]Lopez-Flores I,Garrido-Ramos M A,Herran R la,et al.I-dentification ofMarteilia ref ringensinfecting the razor clamSolen marginatusby PCR and in situ hybridization[J].M ol Cell Probes,2008,22(3):151-155.

[13]Carrasco N,Lopez-Flores I,Alcaraz M,et al.Dynamics of the parasiteMarteiliaref ringens(Paramyxea)inMytilus galloprov incialisand zooplankton populations in Alfacs Bay(Catalonia,Spain)[J].Parasitology,2007,134(Pt 11):1541-1550.

[14]Russell S,Frasca S J,Sunila I,et al.Application of a multiplex PCR fo r the detection of protozoan pathogens of the eastern oysterCrassostrea virginicain field samples[J].Dis Aquat Org,2004,59:85-91.

[15]Haskin H H,Stauber L A,M ackin J A.Minchinia nelsonin.sp.(Haplosporidia,Haplosporidiidae):causative agent of the Delaware Bay oyster epizootic[J].Science,1966,153:1414-1416.

[16]Barber B J,Langan R,Howell T L.Haplosporidiumnelsoni(MSX)epizootic in the Piscataqua River Estuary(Maine/New Hampshire,USA)[J].J Parasitol,1997,83:148-150.

[17]Sunila I,Karolus J,Volk J.A new epizootic ofHaplosporidia(MSX),a haplospo ridian oyster parasite,in Long Island Sound[J].J Shellfish Res,1999,18:169-174.

Development of a Duplex PCR Assay for Detection ofHaplosporidiumandMarteilia ref ringensin Shellfish

XIE Li-ji,XIE Zhi-xun,PANG Yao-shan,LIU Jia-bo,DENG Xian-wen,XIE Zhi-qin

(Guang xi Veterinary Research Institute,N anning,Guang xi,530001,China)

A duplex polymerase chain reaction was optimized to simultaneously detect two pathogens,Haplosporidiumsp.andMarteilia ref ringensin shellfish.Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions on the sequences ofHaplosporidiumsp.andMarteilia ref ringensin Gen-Bank.All samples containingHaplosporidiumsp.andMarteilia ref ringenscould be amplified into two specific bands,244 bp forHaplosporidiumsp.and 478 bp forMarteilia ref ringensby this duplex PCR,but no specific bands of the same sizes were amplified from other shellfish pathogens,such asPerkinsussp.,Aeromonas hydrophila,Pseudomonas f luorescens,Vibrio parahaemolyticu,Vibrio alginolyticu,Vibrio f luvialisandVibrio mimicus.As little as 10 pg ofHaplosporidiumsp.andMarteilia ref ringensDNA could be detected.

Haplosporidiumsp.;Marteilia ref ringens;duplex PCR

S852.723

A

1007-5038(2010)01-0054-04

2009-07-25

國家百千萬人才工程人選專項資金項目(945200603);廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻0630001-3M)

謝麗基(1981-),女,廣西靈山人,碩士,主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究。*通訊作者