趙 耘,杜昕波,李偉杰,陳 敏,康 凱

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

利用菌落多重PCR對傳染性胸膜肺炎放線桿菌進行血清分型

趙 耘,杜昕波,李偉杰,陳 敏,康 凱

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

參照文獻報道的傳染性胸膜肺炎放線桿菌的特異基因合成5對特異引物,建立傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型分型的菌落多重PCR方法,結(jié)果為10株傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型參考菌株均擴增出了相應(yīng)的預(yù)期片段,而支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌的擴增均為陰性。利用此多重PCR方法對41株傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離菌株進行血清型分型,結(jié)果所有菌株均擴增出了相應(yīng)的特異片段,其中6株為1型,5株為7型,1株為5型,29株為9型。

傳染性胸膜肺炎放線桿菌;菌落多重PCR;血清型;分型

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)引起的豬的呼吸道疾病。該病以胸膜肺炎和出血性、壞死性腦炎為特征,具有高發(fā)病率和死亡率的特點[1]。該病在世界范圍內(nèi)廣泛存在,給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。目前,發(fā)現(xiàn)胸膜肺炎放線桿菌有15個血清型(其中5型又分為5a和5b),而且某些血清型之間存在交叉反應(yīng)。不同血清型之間及同一血清型不同菌株之間的毒力均存在差異,從而導(dǎo)致該病的診斷非常困難[2]。研究發(fā)現(xiàn)本菌可產(chǎn)生4種毒素,即apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ和apxⅣ。其中apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ不僅是本菌主要的毒力因子,而且是主要的保護性抗原。apxⅠ主要由1、5、9、11和14型分泌,apxⅡ由除10和14型的所有型菌株分泌,apxⅢ由2、4、6、8和15型分泌,而apxⅣ存在于所有的血清型中,但其只能在豬體內(nèi)表達,此毒素在不同的型之間其大小是不同的[3]。本試驗參照文獻報道[3]合成5對引物建立多重PCR方法,并利用所建立的多重PCR方法對41株傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離菌株進行鑒定和分型,以期為傳染性胸膜肺炎的臨床快速診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 傳染性胸膜肺炎放線桿菌定型參考菌 株 包 括 CVCC259、CVCC260、CVCC261、CVCC262、 CVCC263、 CVCC264、 CVCC265、CVCC266、CVCC267、CVCC268,血清型分別為1 型～10型,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供;傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離菌株41株由獸醫(yī)微生物資源平臺項目收集,保存于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心,編號分別為 CVCC3559～CVCC3595、CVCC3597 ～ CVCC3600,用時供應(yīng) ;支氣管敗血波桿菌 CVCC3000、多殺性巴氏桿菌CVCC431、大腸埃希菌CVCC195由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基Taq酶、10×PCR buffer(含 25 mmol/μ L MgCl2)、dNTP、DNA Marker DL 2 000、瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司;其他培養(yǎng)基均由本所基礎(chǔ)保障室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將凍干保存的多殺性巴氏桿菌用適量馬丁湯溶解,接種改良馬丁瓊脂斜面,37℃過夜培養(yǎng),取斜面培養(yǎng)物劃線接種改良馬丁瓊脂平板(含40 mL/L馬血清和1 g/L血紅素)、普通瓊脂平板以及麥康凱瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24 h;支氣管敗血波氏桿菌和大腸埃希菌是用適量的營養(yǎng)肉湯溶解凍干菌株,接種普通瓊脂斜面,37℃過夜培養(yǎng),取斜面培養(yǎng)物劃線接種普通瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24 h;胸膜肺炎放線桿菌是用適量添加200 mg/L輔酶Ⅰ(NAD)、80 mL/L滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯溶解凍干菌株,接種添加200 mg/L輔酶Ⅰ、80 mL/L滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂斜面,37℃過夜培養(yǎng),取斜面培養(yǎng)物劃線接種添加200 mg/L輔酶Ⅰ、80 mL/L滅活小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂平板[4]。分別取傳染性胸膜肺炎放線桿菌培養(yǎng)物涂片、革蘭染色。單菌落直接作為PCR反應(yīng)的模板進行菌落PCR。

1.2.2 PCR引物合成 參考文獻報道的引物序列[3],由上海Invitrogen公司合成。將各引物濃度稀釋至25 μ mol/L置-20℃保存?zhèn)溆?。引物的序列和位置見?,血清型與片段大小對照見表2。

表1 引物的序列及位置Table 1 The sequence and position of primers

1.2.3 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系為50 μ L,依次加入10×PCR 緩沖液(含 25 mmol/L MgCl2)5 μ L、6 對引物(25 μ mol/L)各 1 μ L 、dNTP(2.5 μ mol/L)4 μ L 、Taq酶(5 U/μ L)1 μ L 、雙蒸水 28 μ L,用滅菌槍頭挑取平板上的單個菌落,懸浮于各PCR反應(yīng)液中。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸3 min,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 特異性檢測 利用以上方法分別對支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌進行多重PCR,以檢測其特異性。

表2 1型～10型菌株P(guān)CR擴增片段大小Table 2 The PCR results of 1-10 serotype of Actinobacillus pleuropneumoniae strains

1.2.5 多重PCR的初步應(yīng)用 將本所保存的41株傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離菌株進行菌落多重PCR。

2 結(jié)果

2.1 傳染性胸膜肺炎放線桿菌的菌體形態(tài)和培養(yǎng)特性

51株傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離株與參考菌株在添加NAD和血清的TSA平板上生長良好,菌落為圓潤、光滑、邊緣整齊的小菌落;在添加NAD和綿羊鮮血的TSA平板上可產(chǎn)生明顯的β溶血;在麥康凱瓊脂平板和普通瓊脂平板上不生長。顯微鏡下可見各菌株均為革蘭陰性球桿菌,具多形性。

2.2 定型參考菌株多重PCR結(jié)果

結(jié)果見圖1、表3。10株定型參考菌株均擴增出了預(yù)期的片段,而用此方法對支氣管敗血波氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、大腸埃希菌進行多重PCR,結(jié)果均未擴增出相應(yīng)的目的片段。

圖1 定型參考菌株多重PCR結(jié)果Fig.1 The PCR results of Actinobacillus pleuropneumoniae references strains

表3 10株定型參考菌株多重PCR片段大小結(jié)果Table 3 The PCR results of 10 Actinobacillus pleuropneumoniae references strains

2.3 多重PCR的初步應(yīng)用

利用此多重PCR方法對41株傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離菌株進行擴增,結(jié)果所有菌株均擴增出了相應(yīng)的特異片段,其中6株為1型,5株為7型,1株為5型,29株為9型。

3 討論

傳染性胸膜肺炎放線桿菌有多個血清型,且不同血清型之間存在著交叉反應(yīng),這給傳染性胸膜肺炎的血清學(xué)檢測造成了極大的困難。自20世紀80年代末期我國出現(xiàn)傳染性胸膜肺炎,近年來對本病的報道逐年增多,現(xiàn)已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,因此快速準確地檢測不同血清型胸膜肺炎放線桿菌對預(yù)防和控制本病有著極其重要的意義。

本研究中10株定型參考菌株為本所保存菌株,其血清型是通過凝集試驗所得,而利用多重PCR的結(jié)果與其完全一致,說明這兩種方法具有較高的符合率。同時用此多重PCR方法對常見的豬呼吸道疾病有關(guān)的病原體如支氣管波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌等均不能擴增出特異性片段,具有良好的特異性。用此方法對41株分離株進行鑒定,結(jié)果6株為1型,5株為7型,1株為5型,29株為9型。

目前已建立了多個用于傳染性胸膜肺炎放線桿菌診斷的PCR方法,分別進行傳染性胸膜肺炎放線桿菌的定性診斷[5]、某個血清型或幾個血清型進行診斷[6-9],或者所建立的方法要分幾步進行[11-12],本研究通過多重PCR對豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的外毒素apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ、apxⅣ基因進行一步擴增,除血清 2型(CVCC260)和 8型(CVCC266)外,其他8種不同血清型的菌株均可區(qū)分開,該結(jié)論與文獻報道一致[7]。目前已知可以根據(jù)血清2型莢膜多糖基因差異設(shè)計引物區(qū)分2型和8型[9]。傳染性胸膜肺炎放線桿菌有15個血清型,本研究中僅涉及到1～10血清型,是否適用于11～15血清型尚有待于進一步驗證。

[1]斯勞特,阿萊爾,蒙加林,等.豬病學(xué)[M].趙德明,張中秋,沈建忠,譯.8版.北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,357-367:957-959.

[2]陳 凡,何啟蓋,程煥春,等.胸膜肺炎放線桿菌I型標準抗血清的制備和初步臨床應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2004,26(6):458-461

[3]Nabin R,Sung J S,Sang G K,et al.Development and use of a multiplex polymerse chain reation assay based on Apx toxin genes for genotyping ofActinobacillus pleuropneumoniaeisolates[J].J Vet Diagn Invest,2005,17:359-362.

[4]羅如松,郭愛珍,林荔雯,等.豬胸膜肺炎放線桿菌濁度與細菌計數(shù)的關(guān)系[J].畜牧與獸醫(yī),2005,37(10):10-12.

[5]Gram T,Ahrens P,Nielsen J P.Evaluation of a PCR detection ofActinobacillus pleuropneumoniaein mixed bacterial cultures from tonsils[J].Vet Microbiol,1996,51:95-104.

[6]Terry M L O,Ward C K.Detection and identification ofActinobacillus pleuropneumoniaeserotype 5 by multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,1998,36(6):1704-1710.

[7]Jessing S G,Angen O,Inzana T G.Evaluation of a multiplex PCR test for simultaneous identification and seroty ping ofActinobacillus pleuropneumoniaeserotypes 2,5,and 6[J].J Clin Microbiol,2003,41(9):4095-4100.

[8]Schucher J A,Inzana T J,Angen O,et al.Detection and Identification ofActinobacillus pleuropneumoniaeserotypes 1,2 and 8 by multiplex PCR[J].J Clin Microbiol,2004,42(9):4344-4348.

[9]Zhou L,Jones S C P,Angen O,et al.Multiplex PCR that can distinguish between immunologically crossreactive serovar 3,6 and 8Actinobacillus pleuropneumoniaestrains[J].J Clin Microbiol,2008,46(2):800-803.

[10]Sthitmatee N,Sirinarumitr T,Makonkey oon L,et al.Identification of theActinobacillus pleuropneumoniaeserotype using PCR based-apx genes[J].Mol Cell Probes,2003,17:301-305.

[11]夏爐明,史一博,李樹清,等.復(fù)合PCR進行胸膜肺炎放線桿菌血清型快速分型[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2007,27(4):497-502.

[12]朱良全,薛青紅,蔣玉文,等.胸膜肺炎放線桿菌血清學(xué)分型多重PCR方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2006,28(5):585-588.

Identification and Seroptyping ofActinobacillus pleuropneumoniaeby the Colony Multiplex PCR

ZHAO Yun,DU Xin-bo,LI Wei-jie,CHEN Min,KANG Kai

(China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing,100081,China)

Five pairs of primers against specific gene were designed and the colony multiplex PCR of identification and serogrouping ofActinobacilluspleuropneumoniaewere developed.10Actinobacillus pleuropneumoniae

trains including serotype 1-10 were identified using the colony multiplex PCR assay.The expected sequences were obtained successfully by the colony multiplex PCR assay.But the sequenceswere notobtained fromE.coli,B.bronchisepticaandP.multocida.41Actinobacillus pleuropneumoniaestrains were identified using the colony multiplex PCR assay.The result showed that all of these strains were obtained the expected sequences by the colony multiplex PCR assay,and 6 strains were serotyps 1,5 strains were serotype 7,1 strain was serotype 5,29 strains were serotype 9.

Actinobacillus pleuropneumoniae;colony multiplex PCR;serotype;serotyping

S852.619;Q789

A

1007-5038(2010)01-0009-04

2009-07-09

國家科技支撐計劃(2006BAD06A11)

趙 耘(1968-),女,陜西西安人,副研究員,博士,主要從事獸醫(yī)微生物鑒定及相關(guān)研究。