周瑞紅 李菊香 夏子榮 顏素娟 譚秋波

(蘇州市木瀆人民醫(yī)院,江蘇 蘇州 215100)

近年有研究發(fā)現(xiàn)心肌營(yíng)養(yǎng)素-1(CT-1)與高血壓心室重塑有一定的關(guān)聯(lián),在 12周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的肥厚心室肌中,CT-1 mRNA明顯升高〔1〕。另有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性或外源性的 CT-1能刺激成纖維細(xì)胞合成DNA及膠原,促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)〔2〕。分化抑制因子(Id)3作為血清誘導(dǎo)的立即早期基因在小鼠成纖維細(xì)胞系中被首次發(fā)現(xiàn),其基因由 3個(gè)外顯子和 2個(gè)內(nèi)含子組成〔3〕。Id3參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,包括骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神經(jīng)形成、骨和血管發(fā)生等〔4～7〕,表明 CT-1與 Id3均存在于成纖維細(xì)胞中,且都有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,但他們之間是否存在某種聯(lián)系,Id3在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況及 CT-1促心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用是否與 Id3有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 出生 1～3 d的SD乳鼠(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科);RT-PCR試劑(Promega,USA);Trizol(Invitrogen,USA);DEPC,二甲基亞砜(DMSO)(Ameresco,USA);DL2000 DNA Ladder Marker(上海生工);MTT增殖檢測(cè)試劑盒(Sigma,USA)。

1.2 方法

1.2.1 心肌成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 在無(wú)菌條件下摘取 4～5只大鼠心臟,分離心室利用蛋白酶消化心肌組織,差速貼壁法獲得原代心肌成纖維細(xì)胞。第 3～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。鑒定方法參照文獻(xiàn)〔9〕。

1.2.2 CT-1反義鏈與正義鏈的設(shè)計(jì)與合成 以硫代磷酸修飾反義和正義寡核苷酸鏈,由上海生物工程有限公司合成,各自序列為:CT-1反義寡核苷酸鏈(ASODN):5′-TGGCTCATGCTGGCCCCAGGCTGAT-3;CT-1正義寡核苷酸鏈(ASODN):5′-ATCAGCCTG′GGGCCAGCATGAGCCA-3′。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施 ①空白對(duì)照組(C):大氣壓下培養(yǎng);②高靜水壓組(P):160 mmHg壓力下培養(yǎng) 8 h〔9〕;③CT-1反義寡核苷酸組(ASODN組):160 mmHg壓力培養(yǎng)下,加入終濃度為 10μmol/L的 ASODN;④CT-1正義寡核苷酸組(SODN):160mmHg壓力培養(yǎng)下8 h,加入終濃度為 10μmol/L的SODN。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè) Id3 mRNA的表達(dá) 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取心肌細(xì)胞總 RNA。參照 Promege公司提供的 RT-PC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),PCR反應(yīng)共 35個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)由 Gen Bank中獲取目的基因全序列,借助 primer primier 5.0軟件設(shè)計(jì)完成,由上海生工合成,各引物序列(含參照序列①和目的序列②)見(jiàn)下 :①β-actin正義 5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′;反義 5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3′,240 bp。②Id3 正義 5′-CATCTCCCGATCCAGACA-3′;反義 5′-TCATAATCAGGGCAACAGAG-3′;494 bp。

1.2.5 蛋白表達(dá)的檢測(cè) Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中CT-1蛋白表達(dá)情況,用 Lab Work 3.0 UVP軟件分析條帶的積分吸光度值,相對(duì)蛋白含量用積分吸光度值表示。

1.2.6 心肌成纖維細(xì)胞增殖檢測(cè)(MTT法) 在各種條件培養(yǎng)下的 96孔板實(shí)驗(yàn)結(jié)束前 4 h,每孔加入 5g/L的 MTT(四氮唑鹽)20μl,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,棄去各孔中的培養(yǎng)基,每孔加入DMSD 150μl,振蕩 10min,酶標(biāo)儀測(cè) 490 nm吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,應(yīng)用 SPSS12.0軟件。組間比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn),多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩組均數(shù)間比較采用 LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 高靜水壓對(duì)心肌成纖維細(xì)胞Id3 mRNA表達(dá)的影響 在160mmHg高靜水壓下,Id3 mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.05);ASODN組 Id 3mRNA的表達(dá)明顯低于 P組和 C組(P＜0.05);SODN組與 P組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖 1,表 1。

2.2 高靜水壓對(duì)心肌成纖維細(xì)胞 CT-1蛋白表達(dá)的影響 在160mmHg高靜水壓下,CT-1蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01);ASODN組 CT-1蛋白表達(dá)明顯低于 P組(P＜0.01);SODN組與P組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表 1,圖 2。

圖1 各組Id3 mRNA表達(dá)電泳圖

表1 各組 Id 3 mRNA、CT-1蛋白表達(dá)灰度值及心肌成纖維細(xì)胞增殖(mTT法)比較(x±s,n=6)

圖2 各組 CT-1蛋白表達(dá)

2.3 MTT檢測(cè)CT-1的ASODN對(duì)高靜水壓刺激成纖維細(xì)胞的影響 成纖維細(xì)胞經(jīng) 160 mmHg的壓力作用 8 h后,明顯增殖(P＜0.05),CT-1ASODN能抑制高靜水壓所致的細(xì)胞增殖(P＜0.05),而 CT-1SODN組對(duì)高靜水壓的促細(xì)胞增殖作用無(wú)影響,表 1。

3 討 論

CT-1主要存在于心臟組織中,是心臟正常生長(zhǎng)、發(fā)育所必需的物質(zhì)。心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞都能表達(dá) CT-1,且心肌中CT-l mRNA濃度和蛋白水平在 Dahl鹽敏感大鼠的左室肥厚階段和充血性心力衰竭階段均明顯增高。另有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性或外源性的 CT-1能刺激成纖維細(xì)胞合成DNA及膠原,促成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。因此 CT-1在心室重塑(包括心肌成纖維細(xì)胞增值、心肌細(xì)胞肥大、膠原沉積等)中發(fā)揮重要作用,而其作用途徑尚有待進(jìn)一步研究。Id又稱DNA結(jié)合抑制因子(inhibitor of differentiation/DNA binding),包括 Id1～I(xiàn)d 4,屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,主要通過(guò)與 A類堿性 HLH(bHLH)蛋白(如E蛋白)結(jié)合而發(fā)揮作用;因其本身缺乏 DNA結(jié)合必需的堿性氨基酸序列,Id蛋白和E蛋白結(jié)合形成異二聚體后能夠阻止 E蛋白和其他 bHLH蛋白結(jié)合,對(duì) bHLH轉(zhuǎn)錄因子活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用〔8～10〕。Id 3作為血清誘導(dǎo)的立即早期基因在小鼠成纖維細(xì)胞系中被首次發(fā)現(xiàn),其表達(dá)受多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控,誘導(dǎo)Id3表達(dá)的因素有:血小板衍生生長(zhǎng)因子、甲狀腺刺激素、表皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子等,不同的刺激因素作用于不同的組織細(xì)胞,通過(guò)不同的信號(hào)途徑,可導(dǎo)致 Id3表達(dá)水平不同程度的升高或降低,其表達(dá)呈細(xì)胞特異性和雙向調(diào)節(jié)性。因此 Id 3參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,包括骨骼肌的分化、血管平滑肌和腫瘤細(xì)胞的增殖、胚胎的神經(jīng)形成、骨和血管發(fā)生等〔4～7〕。

筆者以往的研究發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細(xì)胞在 160 mmHg高靜水壓下培養(yǎng) 8 h后,與對(duì)照組相比心肌成纖維細(xì)胞達(dá)到最大增殖效果〔11〕,本研究發(fā)現(xiàn)在此條件下 CT-1的表達(dá)亦明顯增加,同時(shí)發(fā)現(xiàn) Id 3mRNA在心肌成纖維細(xì)胞中也有明顯表達(dá);當(dāng)使用CT-1ASODN干預(yù)后,心肌成纖維細(xì)胞增殖明顯減弱,CT-1的表達(dá)明顯減少,Id3 mRNA在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)也明顯下調(diào),這表明 CT-1的作用與 Id3 mRNA的表達(dá)有關(guān);而使用CT-1 SODN干預(yù)后,心肌成纖維細(xì)胞增殖、CT-1和 Id3 mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯變化,由此推斷 Id3可能也在 CT-1促心肌成纖維細(xì)胞增殖或者促心肌重塑過(guò)程中發(fā)揮作用。

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