韓 剛,王志剛,賈明庫

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院普通外科,吉林長春130041)

腫瘤的免疫治療是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一,本文通過應(yīng)用CpG ODN刺激人PBMC,觀察其對各種細(xì)胞因子分泌的影響,分析其在腫瘤免疫治療中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人外周血由長春市中心血站提供;人干擾素-a定量酶聯(lián)檢測試劑盒、人干擾素-γ定量酶聯(lián)檢測試劑盒、人腫瘤壞死因子-a定量酶聯(lián)檢測試劑盒、人白介素-12定量酶聯(lián)檢測試劑盒均購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司;CpG 2006由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人PBMC的分離與培養(yǎng) 每份血樣中加入等量生理鹽水混勻稀釋,離心。分離出離心分層后單個(gè)核細(xì)胞層,另加RPMI1640后離心,洗滌2次。計(jì)算活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＞95%。上述的PBMC在無菌條件下、在37℃、5%CO2濃度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞因子的收集 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL,加入24孔培養(yǎng)板,每孔1 000 u L。設(shè)CpG ODN(CpG2006)組和NoCpG ODN組,每組包括2.5,5,10,15 ug/ml四種濃度,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,在24小時(shí)測定培養(yǎng)上清液中IFN-α濃度;72小時(shí)測定IL-12,IFN-α與TNF-γ的濃度。

1.2.3 細(xì)胞因子的檢測 分別建立IFN-α,IFN-γ,TNF-α和IL-12的標(biāo)準(zhǔn)曲線,按試劑盒說明書方法加樣后測吸光值,利用軟件CurveExpert1.34作圖,根據(jù)樣品OD值求出相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

分別采用ELISΑ方法檢測法測定人PBMC釋放的IFN-α,IFN-γ,TNF-α和 IL-12 的濃度,結(jié)果表明CpGODN組的3種細(xì)胞因子濃度均高于NoCpGODN組,差異有顯著性(P＜0.05)。且其刺激人PBMC釋放4種細(xì)胞因子的量與CpG ODN的濃度成正性依賴關(guān)系(表1-4)。

表1 CpG2006誘導(dǎo)人PBMC釋放IFN-α的濃度(PG/ml,n=9)

表2 CpG2006誘導(dǎo)人PBMC釋放IFN-γ的濃度(PG/ml,n=9)

表3 CpG2006誘導(dǎo)人PBMC釋放TNF-α的濃度(PG/ml,n=9)

表4 CpG2006誘導(dǎo)人PBMC釋放IL-12的濃度(PG/ml,n=9)

3 討論

CpG ODN具有激活宿主免疫系統(tǒng)的能力,可刺激機(jī)體活化對腫瘤的先天免疫并增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫[1]。本研究發(fā)現(xiàn),B型CpG ODN(CpG2006)能夠有效地刺激人PBMC的增殖,并誘導(dǎo)其釋放抗腫瘤的細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CpG 2006明顯上調(diào)PBMC分泌IFN-α。CpG ODN通過PDC細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)激活I(lǐng)RF5(interferon regulatory factor 5)發(fā)生磷酸化,形成二聚體后進(jìn)入細(xì)胞核,與共同活化因子CBP/P300結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性,釋放IFN-α[2];Sugimoto等發(fā)現(xiàn)CpG ODN通過TLR9激活下游信號(hào)NF-kB,刺激PDC活化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Cot/Tp12)途徑釋放IFN-α[3]。局部產(chǎn)生的IFN-α能刺激NK細(xì)胞的分化并增加局部NK細(xì)胞殺傷作用。PDC釋放的上述細(xì)胞因子可刺激NK細(xì)胞與T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,IFN-γ和IL-12可形成正反饋途徑,在調(diào)節(jié)Th亞群分化上具有協(xié)同作用,促使Thl極性化。這些細(xì)胞因子共同發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,并以網(wǎng)絡(luò)形式啟動(dòng)抗腫瘤免疫。

研究認(rèn)為,CpG ODN使PDC成熟并表達(dá)高水平的MHC-II,CD40,CD80,CD86,激活 Thl細(xì)胞表達(dá)CD40L(CD154),CD40L又形成正反饋刺激PDC產(chǎn)生IL-12。IL-12的抗腫瘤作用與促進(jìn)NK,CTL和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性有關(guān)。IL-12激活的NK細(xì)胞可直接引起腫瘤細(xì)胞的死亡,并破壞腫瘤血管上皮的完整[3]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CpG ODN可以誘導(dǎo)人PBMC釋放I FN-γ。I FN-γ主要由活化的NK細(xì)胞和胸腺起源的T細(xì)胞產(chǎn)生,IFN-γ在宿主的免疫防御中是一種多效性的細(xì)胞因子,PDC釋放的IFN-α。國外的研究發(fā)現(xiàn),用TNF-γ的單克隆抗體處理免疫源性較強(qiáng)的纖維肉瘤的動(dòng)物模型,其腫瘤的發(fā)展較對照組迅速,顯示IFN-γ對腫瘤的抑制作用[4]。在腫瘤的發(fā)展過程中,腫瘤細(xì)胞可通過多種機(jī)制逃避宿主的免疫監(jiān)視。CpG ODN可以誘導(dǎo)人PBMC釋放多種抗腫瘤作用的細(xì)胞因子,可打破腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的微環(huán)境,有利于機(jī)體通過多種方式產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用。

因此,本實(shí)驗(yàn)證實(shí),CpG ODN可誘導(dǎo)人PBMC增殖并釋放多種抗腫瘤細(xì)胞因子,增加宿主對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視。盡管這樣,以往的調(diào)查顯示在具有完整免疫系統(tǒng)的宿主仍會(huì)有腫瘤發(fā)生。深入研究發(fā)現(xiàn),其腫瘤免疫源性明顯弱于有免疫缺陷宿主發(fā)生的腫瘤,這和人類絕大多數(shù)的腫瘤缺乏腫瘤特異性抗原相一致。同時(shí)也表明在腫瘤的發(fā)生過程中,腫瘤細(xì)胞缺乏腫瘤特異性抗原是腫瘤細(xì)胞對宿主的免疫選擇。因此上調(diào)宿主的免疫平衡,打破腫瘤局部免疫環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的耐受將是抗腫瘤免疫研究的焦點(diǎn)。

[1]Weiner GJ,Liu HM,Wooldridge JE,et al.Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94:10833.

[2]Schoenemeyer A,Barnes BJ,Mancl ME,et al.The interferon regulatory factor,IRF5,is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling[J].J Biol Chem,2005,280:17005.

[3]Sugimoto K,Ohata M,Miyoshi J,et al.A serine/threonine kinase,Cot/Tpl2,modulates bacterial DNA-induced IL-12 production and Th cell differentiation[J].J Clin Invest,2004,114:857.

[4]Klinman DM,Yi AK,Beaucage SL,et al.CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6,interleukin 12,and interferon gamma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93:2879.