王 丹，鄒 莉，楊民寶，伊洪偉，羅 麗，王 義

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

“桑黃”是擔子菌中針層孔菌屬 （Phellinus Quel.）一類具有重要藥用價值的大型真菌，近幾年來成為傳統(tǒng)中藥研究和開發(fā)的熱點，但由于這類真菌在藥用功效上確實相同或相似，因此在學術(shù)和市場交流中出現(xiàn)了多種同種異名、同名異種的混亂 “桑黃”物種[1]。

通過對東亞地區(qū) “桑黃”物種[2]進行了詮釋，在傳統(tǒng)的形態(tài)分類的基礎(chǔ)上，試圖通過ITS序列分析，對中國的鮑氏針層孔菌 （桑黃）（Phellinus baumii）過去定名為裂蹄針層孔菌 （P.linteus）與朝鮮桑黃 （Phellinus linteus）、韓國桑黃 （Phellinus linteus）進行同源性比對，確定其親緣關(guān)系，證明是否是同一物種鮑氏針層孔菌 （桑黃）（P.baumii），為其分類鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株朝鮮桑黃 （Phellinus linteus）、韓國桑黃 (Phellinus linteus)、中國桑黃 (Phellinus baumii)、中國桑黃火木針層孔菌 （Phellinus igniarius）、斜生褐孔菌 (Phaeoponus obliquus)由東北林業(yè)大學潘學仁教授提供，文中分別以sh1、sh2、sh3、sh4、sh5表示，其中朝鮮桑黃和韓國桑黃其產(chǎn)地和形態(tài)特征是不同的。

DNA提取和檢測：用接種鉤刮取培養(yǎng)基表面適量菌絲，置于研缽中用液氮冷卻，迅速研磨成細粉，將其放入1.5 mL離心管中，加入少量的 PVP、500 μL預(yù)熱的 2%CTAB提取緩沖液及20 μL β－疏基乙醇，輕輕混勻，置65℃水浴鍋中溫浴30 min，其間不時輕輕搖動離心管，使材料充分混勻。取出放至室溫，加入500 μL氯仿:異戊醇（體積比 24∶1）， 緩慢顛倒混勻， 12 000 r·min－1離心 10 min。將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，棄下層。重復(fù)抽提2次，直至中間層透明。吸取上清液放入1.5 mL離心管中，加入3 mol·L－1NaAc，混勻后，加入2/3體積的異丙醇，室溫沉淀1 h以上，12 000 r·min－1離心10 min，棄上清。加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇洗滌1次，再加入1 mL預(yù)冷的無水乙醇洗滌，以除去DNA表面附著的鹽或試劑小分子物質(zhì)。室溫干燥后，加入30 μL的無菌去離子水溶解DNA，放于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物序列

ITS1：5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG －3’； ITS4： 5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’，引物由上海生工生物公司合成。

1.3 PCR擴增反應(yīng)體系

制備 25 μL 反應(yīng)體系， 其中 ddH2O 18.375 μL、 模板DNA 1 μL、 10×buffer （Mg2+）2.5 μL、 濃度為 10 μmol·L－1正 反 向 引 物 （ITS1 和 ITS4）各 0.5 μL、 dNTP 2 μL、TaqDNA 聚合酶 0.125 μL。

1.4 PCR反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性 5 min， 95℃變性 30 s， 58℃退火 45 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物的檢測

取5 μL PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 PCR產(chǎn)物的測序

PCR擴增產(chǎn)物，委托上海生工生物公司測序后，將測序的ITS序列在NCBI Genbank進行BLAST，對獲得的同源序列進行序列分析。利用BioEdit的Sequence工具下的Nucleotide Compisition分析各菌株ITS序列的長度及核苷酸G+C含量，采用MEGA3.1系統(tǒng)發(fā)育分析軟件中的UPGMA法和Clustal X1.83構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳效果圖

供試菌株ITS分布情況見表1，G+C的含量比較見表2，同源性比較見表3。

表1 供試菌株ITS分布長度的比較

表2 供試菌株ITS的G+C含量分布情況

表3 供試菌株ITS同源性比較

2 結(jié)果與分析

2.1 rDNA ITS序列的擴增、測序

擴增結(jié)果見圖1。

從圖1可看出，引物ITS1和ITS4能成功擴增出5個菌株的ITS區(qū)段，經(jīng)測序5個菌株的ITS序列片段長度分別為704 bp、669 bp、681 bp、588 bp、738 bp，所得序列結(jié)果經(jīng)堿基比對和分析后提交NCBI中的Genbank數(shù)據(jù)庫，并獲得Genbank中的登錄號，分別為FJ190410、FJ190411、 FJ190412、 FJ190413、 FJ190414。

2.2 供試菌株親緣關(guān)系分析

從表2可以看出，5個供試菌株中其中sh1、sh2、sh3之間的5.8S rDNA的G+C具有100%的同源性，說明其保守性和親緣關(guān)系均相當強。從以上數(shù)據(jù)可以看出，作為對照的針孔菌屬 （Phaeoponus）的sh5明顯和針層孔菌屬（Phellinus）的sh1、sh2、sh3親緣關(guān)系較遠，這說明桑黃菌株親緣關(guān)系的鑒定可以采用ITS序列分析的方法，sh1、sh2和sh3是同一物種，sh4和sh5是另外2個不同的物種。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)美國生物中心 （NCBI）網(wǎng)站提供的真菌ITS1和ITS2的相關(guān)序列來確定供試菌株的親緣關(guān)系，經(jīng)BLAST比對，下載了與供試菌株同源性較高的ITS序列，通過Clustal X軟件對其進行比對，并用分子進化遺傳分析軟件（Clustal X1.83，Mega 3.1）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，如圖2所示。

圖2 5個菌株的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹

從系統(tǒng)發(fā)育圖中可以看出，與sh1、sh2、sh3親緣關(guān)系較近的是基因庫中提供的Phellinus linteus、Phellinus baumii、 Inonotus linteus， 而sh4與Phellinus laevigatus較近、sh5與Inonotus obliquus較近。經(jīng)BLAST比對，基因庫中與sh1同源性高于90%以上的DNA序列有61個菌株，其中Phellinus linteus 25個，Phellinus baumii 15個；與sh2同源性高于90%以上的有73個，其中Phellinus linteus 27個，Phellinus baumii 23個；與sh3同源性高于90%以上的有54個，其中Phellinus linteus 23個，Phellinus baumii 17個；而與sh4同源性高于90%以上的菌株大多數(shù)為Phellinus laevigatus；與sh5同源性高于90%以上的菌株大多數(shù)為Inonotus obliquus。

從上述分析可看出，sh1、sh2、sh3是同一物種，名稱混亂的 “桑黃”，而sh4和sh5分別是火木針層孔菌和斜生褐孔菌。

親緣關(guān)系較近的sh1、sh2、sh3的ITS序列與基因庫中提供的Phellinus linteus、Phellinus baumii都有較高的同源性，在這些菌株中，Phellinus linteus占多數(shù)。從數(shù)據(jù)顯示中可以認為sh1、sh2、sh3與Phellinus linteus的親緣關(guān)系較近，因此sh1、sh2、sh3的拉丁學名應(yīng)為Phellinus linteus。但是對于這些Phellinus linteus的ITS序列，都是由韓國和中國學者提供，并沒有發(fā)現(xiàn)有中美洲和南美洲學者提供的，戴玉成等從形態(tài)學角度研究確定Phellinus linteus的自然分布僅在中美洲和南美洲，而中國、韓國、印度、俄羅斯以及日本等國家并沒有自然分布，這些國家學者所描述的菌物 “Phellinus linteus”，其正確的物種名稱應(yīng)為Phellinus baumii[3,4]。所以基因庫中由韓國和中國學者提供的與供試菌株同源性較高的的Phellinus linteus，其真正拉丁學名應(yīng)為Phellinus baumii，也就是與供試菌株sh1、sh2、sh3同源性較高、親緣關(guān)系較近的菌株應(yīng)為Phellinus baumii。經(jīng)上述分子生物學分析，筆者支持戴玉成的觀點，中國、朝鮮、韓國交流的 “桑黃”的物種為鮑氏針層孔菌（P.baumii Pilat），而桑黃、桑耳、針裂蹄、裂蹄針層孔菌均為鮑氏針層孔菌的異名[5]。

3 結(jié)果與討論

對于分類混亂的、學名不定的菌株，經(jīng)BLAST分析比較時，不能只看基因庫中顯示的菌株名稱來確定其親緣關(guān)系，因為，基因庫中學者提供的菌株學名有些是在分類比較混亂的時候提供的，這個時候提供的并不一定是其真正的學名，例如筆者在提供 “桑黃”菌株時，并不確定其真正學名為Phellinus linteus，只是目前大多數(shù)學者認為的，所以在提交時就以Phellinus linteus提交，結(jié)果在基因庫中最后顯示的為Phellinus linteus。

從本試驗結(jié)果來看，由于ITS片斷較小和短，因此對于菌株之間的區(qū)分有一定的局限性，但對一些大的區(qū)段如18S rDNA效果會更好。筆者建議，結(jié)合形態(tài)特征對中國的 “桑黃”與中美洲和南美洲的Phellinus linteus ITS序列進行比較分析，進一步確定其真正的親緣關(guān)系。遺憾的是，筆者沒有在基因庫中發(fā)現(xiàn)與 “桑黃”菌株相似度較高的由中美洲和南美洲學者提供的Phellinus linteus的ITS序列，且沒有收集到中美洲和南美洲的Phellinus linteus作為對照菌株。

[1]曾念開，王秋穎，蘇明聲.桑黃基原物種的探討[J].中國食用菌，2008， 27(2)： 56-59.

[2]潘學仁，鄒莉.東亞地區(qū) “桑黃”物種問題探討[J].中國食用菌，2008， 27(1)： 63-64.

[3]張小青，戴玉成.中國真菌志第二十九卷銹革孔菌科[J].北京：科學出版社，2005.

[4]Dai YC,Xu MQ.Studies on the medicinal polypore,Phellinus baumii,and itskin,P.linteus[J].Mycotaxon,1998,67(1):191-200.

[5]戴玉成.藥用擔子菌-鮑氏層孔菌 （桑黃）的新認識[J].中草藥，2003， 34(1)： 94-95.