丁晶晶,張德平

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院呼吸科,江蘇南京,210008)

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎(CAP)最主要的病原菌,此外,肺炎鏈球菌感染還可導(dǎo)致菌血癥、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎等多種疾病。近幾年來,耐青霉素肺炎鏈球菌的比例呈逐年上升趨勢。迫切需要快速、可靠的診斷方法來指導(dǎo)耐藥株感染的早期有效治療。傳統(tǒng)敏感性測定方法至少需要24 h,因此在嚴(yán)重感染中,常常需要先進(jìn)行經(jīng)驗性治療,廣譜抗生素的頻繁使用會進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,PCR技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于病原體的檢測,但應(yīng)用于藥敏測定的相關(guān)報道比較少見。PCR方法具有快速、敏感、操作簡單、重復(fù)性好、不依賴于活菌等優(yōu)點,因此在本實驗中,作者將PCR方法應(yīng)用于肺炎鏈球菌青霉素耐藥性的檢測,以尋求最佳快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

optochin紙片(OXOID,UK);MueLLer-Hinton培養(yǎng)基(OXOID,UK);哥倫比亞培養(yǎng)基(OXOID,UK);Taq聚合酶(TAKARA,Japan);HinfI內(nèi)切酶(TAKARA,Japan);VIABANKTM菌種保存盒(MW&E,UK);細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(AXGEN,USA);高速冷凍離心機Z-303K(HERMLE,Germany);PCR擴增儀PTC-100TM(MJ Research Inc,USA);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀3 000 Xi(Biorad,USA);捷達(dá)凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司);H.SWX-600BS數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(上海新苗醫(yī)療器械公司);所有PCR引物均由invitrogen公司合成提供。

1.2 菌株的采集、分離和鑒定

收集了2005年3月～2007年6月江蘇省南京地區(qū)7所醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院、南京市鼓樓醫(yī)院,南京市兒童醫(yī)院,江蘇省人民醫(yī)院,南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院,南京市第一醫(yī)院)微生物室分離的肺炎鏈球菌菌株共180株,其中130株來自患者,50株來自健康體檢者,其標(biāo)本來源主要為痰、血、腦脊液、鼻咽拭子、中耳分泌物、眼分泌物、膿汁、氣管抽吸物等。標(biāo)本采集1 h內(nèi)接種于哥倫比亞瓊脂血平板,置5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育,分離出的菌株用optochin紙片和膽汁溶菌試驗鑒定為肺炎鏈球菌,菌株于VIABANKTM菌種保存管中-70℃冰凍保存。

1.3 青霉素敏感性檢測

青霉素的最低抑菌濃度(MIC)測定按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)(原美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會NCCLS)推薦的瓊脂稀釋法,采用含5%脫纖維羊血的M-H藥敏培養(yǎng)基進(jìn)行測定,37℃、5%CO2條件下孵育18～24 h后觀察結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49619跟隨全程作為質(zhì)量控制。結(jié)果判定依據(jù)2004年NCCLS標(biāo)準(zhǔn):MIC≤0.06 μ g/mL, 敏感;0.12 ～1.0 μ g/mL,中介;≥2.0 μ g/mL,耐藥 。

1.4 細(xì)菌基因組DNA的提取

將肺炎鏈球菌接種于哥倫比亞血平板上,37℃、5%CO2孵育18 h,用滅菌雙蒸水將2×109CFU細(xì)菌制成混懸液收集于2 mL無菌離心管中,基因組DNA的提取按照Axygen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明進(jìn)行,所得產(chǎn)物-20℃保存作為PCR反應(yīng)的模板。隨機選取10株菌株,將其細(xì)菌混懸液倍比(10倍)稀釋后提取DNA,用于檢測各PCR方法的敏感度。

1.5 PCR法擴增pbp1A 、pbp2B、pbp2X 基因

引物見表1,其中pbp1A的引物根據(jù)青霉素不敏感株(PNSSP)設(shè)計,pbp2B、pbp2X的引物根據(jù)青霉素敏感株(PSSP)設(shè)計[1],擴增體系如下:25ng DNA模板,1.5 mmol/L MgCL2,200 μ mol/L dNTP,1 U Taq 聚合酶,總反應(yīng)體積為25 μ L。94℃預(yù)變性 5 min,94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)30次后再延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外光下成像。每批反應(yīng)均含陰性對照和陽性對照且重復(fù)1次。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎鏈球菌菌株來源

130株臨床分離肺炎鏈球菌菌株分別來自以下標(biāo)本:痰80.8%(105/130),血培養(yǎng)5.4%(7/130)、腦脊液1.5%(2/130)、中耳分泌物5.4%(7/130)、眼分泌物2.3%(3/130)、膿汁2.3%(3/130)、氣管抽吸物2.3%(3/130)。這些標(biāo)本主要從急性支氣管肺炎(61.5%)、肺炎(20.8%)、菌血癥(5.4%)、中耳炎(5.4%)、上呼吸道感染(3.1%)、結(jié)膜炎(2.3%)和腦膜炎(1.5%)病人中獲取?；颊咂骄挲g3歲(1個月～88歲),男性62.3%,42.3%的患者曾在入院前1周內(nèi)使用過青霉素,70%在1年內(nèi)使用過青霉素。健康定殖者年齡分布為18～40歲,沒有人在1年內(nèi)使用過青霉素。

表1 PCR擴增引物序列

2.2 青霉素耐藥情況

所有從健康體檢者分離的定殖菌株均對青霉素敏感,而從臨床患者分離的菌株中,青霉素的耐藥率較高,為51.5%,見表2。由于大多數(shù)健康分離株來自兒童,作者將患者分為2組:兒童組(1個月～14歲),成人組(>14歲～88歲)。數(shù)據(jù)表明,2組在青霉素耐藥水平上的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,兒童組的耐藥率(65.6%)顯著高于成人組(P<0.01),且MIC50和MIC90均高于成人組。共有83株敏感株,30株中介株和67株耐藥株被納入下一步分析。

表2 130株肺炎鏈球菌臨床分離株青霉素最低抑菌濃度(MIC)

2.3 PCR法

在青霉素敏感株(MIC≤0.06 μ g/mL)中,僅可擴增出pbp2B和pbp2X基因,產(chǎn)物長度分別為359 bp和277 bp;在青霉素不敏感株中(MIC≥0.125 μ g/mL),僅可擴增出片段長度為423 bp的pbp1A基因。表3總結(jié)了不同PCR結(jié)果與不同耐藥水平之間的關(guān)系,敏感組與中介組、敏感組與耐藥組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,通過比較中介組和耐藥組作者發(fā)現(xiàn),當(dāng)以pbp2B或者pbp2X陽性作為診斷標(biāo)準(zhǔn)時,這2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但該法用于診斷中介株和耐藥株敏感性較差,分別為26.1%、72.7%。表4中比較了不同診斷標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)的敏感性、特異性、陽性預(yù)計值、陰性預(yù)計值。在青霉素敏感株中,最佳診斷標(biāo)準(zhǔn)為pbp2B、2X陽性、pbp1A陰性,敏感性、特異性分別為94.2%、96.8%;而在青霉素不敏感株中,最佳診斷標(biāo)準(zhǔn)為 pbp2X陰性,敏感性、特異性分別為97.8%、89.9%。用于檢測的最低菌量為2～20 CFU。

表3 不同PCR結(jié)果與青霉素耐藥水平的關(guān)系(%)

表4 PCR法用于青霉素耐藥性診斷時不同診斷標(biāo)準(zhǔn)所對應(yīng)的敏感性、特異性、陽性預(yù)計值、陰性預(yù)計值

3 討 論

沈敘莊等[2]研究了國內(nèi)4個城市肺炎鏈球菌兒童分離株的青霉素不敏感率,發(fā)現(xiàn)總比例41%,其中,廣州60.8%,西安45%,上海37%,北京25.9%。Song JH等[3]從11個亞洲國家收集了685株肺炎鏈球菌臨床分離株,PNSSP比例為52.4%,越南不敏感率最高為71.4%。作者的研究表明,南京地區(qū)PNSSP率74.6%,顯著高于國內(nèi)其它城市,應(yīng)當(dāng)引起高度重視。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),兒童分離株不敏感率要顯著高于成人,且MIC水平也顯著高于成人,這與先前的報道一致。Jones RN等[4]研究了患者年齡與肺炎鏈球菌耐藥率的關(guān)系,他們發(fā)現(xiàn)在兒童中,尤其是0～5歲患者,其青霉素耐藥率顯著高于成人,且對其它β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素等也有較高的耐藥率。國內(nèi)尚未有相關(guān)報道。兒童人群中青霉素的高耐藥率可能與兒童中耳炎、鼻竇炎的高發(fā)病率有關(guān)[5]。南京地區(qū)青霉素不敏感率較高,因此有必要尋求快速的青霉素敏感性診斷方法,以盡早針對性使用窄譜抗生素,避免耐藥株的進(jìn)一步傳播。

之前有很多關(guān)于探討肺炎鏈球菌鑒定、診斷方法的報道,如乳膠凝集試驗(LA)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、對流免疫電泳(CIE)[6]等。研究表明這些方法均可用于肺炎鏈球菌的診斷,但由于敏感性、特異性有限,且需要105/mL的菌液濃度才可檢出,不能用于藥敏的測定[7-9],因此有很大的局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,PCR被廣泛應(yīng)用于肺炎鏈球菌及其藥敏的檢測。PCR具有敏感,快速,操作簡便,可重復(fù)性好,不受先前用藥以及宿主免疫反應(yīng)的影響等優(yōu)點,因此,巢式 PCR、復(fù)式 PCR、PCR-RFLP等被用于肺炎鏈球菌青霉素敏感性的檢測。

JaLaL H等[1]收集了來源于美國、英國、肯亞、羅馬尼亞、沙特阿拉伯共230株肺炎鏈球菌臨床分離株,利用該方法共檢出93%的敏感株,85%的中介株和100%的耐藥株,但不同地區(qū)的檢測結(jié)果差異較大。推測其敏感性、特異性因地而異可能與不同地區(qū)耐藥突變類型的差異有關(guān),某些差異沒有改變對青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的親和力,但影響了引物與靶位的結(jié)合[10]。迄今為止,國內(nèi)沒有PCR方法用于青霉素敏感性檢測的相關(guān)報道。該方法具有操作簡便的優(yōu)點,可在常規(guī)微生物室得到推廣應(yīng)用。作者的研究表明,該方法能夠較好地區(qū)分出青霉素敏感株和耐藥株,但不能理想地鑒定出中介株,因此本方法可用于診斷青霉素敏感株和不敏感株。通過比較不同擴增產(chǎn)物在診斷敏感株、不敏感株時的敏感性、特異性等,總結(jié)出了最佳診斷標(biāo)準(zhǔn)。作者應(yīng)用了普通Taq聚合酶而不是熱啟動聚合酶,且得到了較理想的結(jié)果,使得該方法的條件更容易控制,實用性更強。

PCR法用于耐青霉素肺炎鏈球菌的快速檢測較傳統(tǒng)藥敏方法快捷、敏感、不依賴于活菌,但也存在一定缺陷,不能較好地區(qū)分出中介株和耐藥株,因此,今后的研究作者需要進(jìn)一步擴大菌株樣本量尤其是中介株的數(shù)目,通過對本地區(qū)肺炎鏈球菌耐藥株的突變類型進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測,根據(jù)其突變特點設(shè)計出更為理想的分子生物學(xué)快速檢測方法,以指導(dǎo)臨床用藥。

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