師紅磊,陳 偉,李 寧,湯旭東,余松濤,王 健,楊仕明

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍消化病研究所,2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院放射科,重慶,400038)

肝素酶(heparanase,HPA)是1999年由四個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室克隆成功的一種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[1],為內(nèi)源β-D-葡萄糖醛酸酶,定位于溶酶體和高爾基體,在腫瘤血管生成、腫瘤生長、浸潤和0轉(zhuǎn)移中起重要作用。其生物學(xué)功能主要包括:降解基底膜(BM)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分——硫酸乙酰肝素多糖鏈(HSPGs),破壞細(xì)胞微環(huán)境的屏障,促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[2];釋放和激活結(jié)合在HSPGs上的生物因子,使其與腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合,刺激細(xì)胞增生、抗凋亡以及血管生成等惡性轉(zhuǎn)化特質(zhì)[3]。大量的臨床研究表明,在大多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞中肝素酶的表達(dá)水平升高,其表達(dá)水平的高低與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后相關(guān)[4-8]。HPA越來越被人們重視,有關(guān)HPA抗體國外已多家生物公司有售,但價(jià)格相對(duì)昂貴。本研究的目的在于制備基于HPA全長氨基酸序列的單克隆抗體,為下一步基于HPA單克隆抗體的腫瘤分子顯像研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料菌種、質(zhì)粒:所用菌株E coli BL21(DE3)、DH5α、SP2/0細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存;pET30a(+)購自Novagen公司;pcDNA3-HPA為我室構(gòu)建;Balb/c小鼠來自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑:限制性內(nèi)切酶,ExTaq酶(TaKaRa公司);T4DNA連接酶,膠回收試劑盒(美國Promega公司);質(zhì)粒小提試劑盒(美國Omega公司);DNA Marker(上海生工);胎牛血清(美國Hyclone);弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(Sigma公司);克隆抗體亞類鑒定試劑盒(SIGMA公司);HRP標(biāo)記的羊抗兔購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;純化所用層析柱及填料購自Amersham公司;其它試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 人肝素酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建:從NCBI GenBank提供的人肝素酶cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引 物。 正 向 引 物:5′CGGAATTCGGTGGTGGTCAGGACGTCGTGGACCTG 3′;反向引物 :5′CCGCTCGAGTCAGATGCAAGCAGCAAC TTTG 3′,劃線部分為EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以載有肝素酶 cDNA全長的pcDNA3質(zhì)粒載體為模板進(jìn)行PCR,退火溫度選擇在60℃,30個(gè)循環(huán),擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后,連接至pET-30a(+)原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)上,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)中,EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切的方法鑒定重組質(zhì)粒,陽性重組質(zhì)粒再進(jìn)行測序測定。

1.2.2 人重組肝素酶融合蛋白的表達(dá):測序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)中,按常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),6 000 r/min離心3 min收集菌體,用超聲破菌儀裂解菌體并高速離心分離細(xì)菌上清和沉淀,15%SDS-PAGE電泳鑒定其可溶性情況。

1.2.3 人肝素酶融合蛋白純化及質(zhì)譜分析:經(jīng)表達(dá)條件優(yōu)化后進(jìn)行大量誘導(dǎo)蛋白,分離包涵體溶于含有8 M尿素的His-Binding buffer(20 mmol/L Na2HPO4,0.5 mol/L NaCl,pH 7.4),充分溶解后上Ni柱純化,采用含8 mol/L尿素的His-E-lution buffer(20 mmol/L Na2HPO4,0.5 mol/L NaCl,500 mmol/L咪唑,pH 7.4),分別收集穿透及洗脫蛋白,15%SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。電泳鑒定后將純化做質(zhì)譜分析,純化產(chǎn)物用BCA法蛋白定量。

1.2.4 人肝素酶蛋白單克隆抗體制備:將純化的人肝素酶重組蛋白從用pH 7.4的 0.01 mol/L PBS將其稀釋到0.6 mg/mL,與等體積弗氏完全佐劑混合后采用雙注射器互推法乳化抗原。免疫程序:首次免疫,60 μ g/只(0.1 mL)人肝素酶重組蛋白+等體積弗氏完全佐劑,皮內(nèi)多點(diǎn)加腹腔注射;第3天采用與第1次相同的佐劑及劑量沖擊免疫和第28天進(jìn)行第3次免疫,佐劑改為弗氏不完全佐劑,抗原量、注射體積及途徑不變;之后每4周1次腹腔加強(qiáng)免疫,第4～5次免疫后間接ELISA法測定效價(jià),細(xì)胞融合前3天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。取達(dá)到高效價(jià)的免疫小鼠脾臟與SP2/0細(xì)胞融合,10 d后間接ELISA篩選陽性克隆,并采用其它相關(guān)蛋白排除抗標(biāo)簽蛋白及菌體蛋白的克隆,數(shù)次克隆化后凍存,并采用腹水法大量制備抗體。

1.2.5 小鼠腹水制備單克隆抗體并純化及鑒定:選用健康雌性Balb/c小鼠10只,腹腔注射0.5mL石蠟油/鼠,1-2周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞106/鼠;等小鼠明顯產(chǎn)生腹水后拉頸處死,用吸管從腹腔取出腹水。制備的腹水經(jīng)二氧化硅去除脂質(zhì)后用HiTrap rProtein A HP純化抗體,純化的抗體用SIGMA亞類試劑盒測定其亞類,并用競爭ELISA測定相對(duì)親和力。Lowry法測定抗體濃度,將抗體分裝冷凍保存。

2 結(jié) 果

2.1 人肝素酶蛋白編碼序列的擴(kuò)增

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,可見大小約1 600 bp的產(chǎn)物,與人肝素酶蛋白編碼序列1 527 bp長度相符(圖1),EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切連接至pET-30a(+),提取質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)測序完全正確。

圖1 人肝素酶蛋白擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 人肝素酶融合蛋白的表達(dá)

經(jīng)測序驗(yàn)證的pET-30a(+)-HPA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主BL21(DE3),經(jīng)1.0 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h。電泳結(jié)果表明pET-30a(+)-HPA在BL21中表達(dá)融合蛋白,分子量為63 KD左右,表達(dá)量占菌體總蛋白的10%以上。經(jīng)鑒定表達(dá)蛋白破菌后幾乎都存在于沉淀中,為包涵體表達(dá)(圖2)。

圖2 重組人肝素酶誘導(dǎo)表達(dá)

2.3 人肝素酶融合蛋白純化及質(zhì)譜分析

大量表達(dá)分離的包涵體溶于含有8 mol/L尿素緩沖液經(jīng) Ni柱純化后,純化后的純度約為90%,結(jié)果見(圖3)。由于純化后始終由兩條小的片斷除不去,1個(gè)片段在48 kD左右,1個(gè)片斷在45 kD左右,送片斷做質(zhì)譜分析,結(jié)果表明兩個(gè)小片段也是人類肝素酶蛋白。BCA法蛋白定量濃度為9 g/L。

2.4 人肝素酶蛋白單克隆抗體制備

使用重組人肝素酶蛋白包被ELISA板,間接ELISA篩選出強(qiáng)陽性克隆 24孔,進(jìn)一步使用pET-30a(+)空質(zhì)粒誘導(dǎo)菌破菌蛋白以及相同質(zhì)粒重組CGRP蛋白為對(duì)照,篩選人肝素酶蛋白特異性抗體15株。經(jīng)四次克隆化后10株抗體達(dá)到100%陽性,能穩(wěn)定分泌抗體,準(zhǔn)備大量制備腹水純化抗體。

圖3 人肝素酶融合蛋白Ni柱純化結(jié)果

2.5 小鼠腹水制備單克隆抗體并純化及鑒定

制備的腹水經(jīng)二氧化硅去除脂質(zhì)后用Hi-Trap rProtein A HP純化抗體,純化的抗體用SIGMA亞類試劑盒測定其亞類,10株抗體有8株IgG和兩株IgM,經(jīng)競爭ELISA測定相對(duì)親和力結(jié)果如下(表1),綜合親和力及亞類最終確定1B11、3H11、4H8進(jìn)一步鑒定。

表1 10株單抗的亞類及親和力的測定

2.6 抗人肝素酶單克隆抗體的特異性鑒定

ELISA法檢測抗體特異性經(jīng)測定結(jié)果如下(圖 4),3株 IgG 抗體(1B11、3H11、4H8)均為抗重組人肝素酶蛋白,均不與相同載體及宿主菌誘導(dǎo)上清反應(yīng),同時(shí)不與相同表達(dá)方式的無關(guān)重組GST蛋白反應(yīng),初步可以確定為人肝素酶蛋白特異性抗體,進(jìn)一步Western blotting鑒定(圖5),抗體均為抗重組人肝素酶蛋白,均不與相同載體及宿主菌誘導(dǎo)上清反應(yīng),結(jié)果與 ELISA鑒定一致。

3 討 論

圖4 ELISA法檢測抗體特異性

圖5 Western blotting鑒定抗體特異性

本研究主要涉及人肝素酶蛋白的原核表達(dá)、純化及其單克隆抗體的制備、純化和鑒定。通過將人肝素酶蛋白編碼序列克隆入pET30-a(+)原核表達(dá)載體,再將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),取所得菌體裂解液上清,經(jīng)鎳柱純化,獲得較高純度的人肝素酶融合蛋白,證實(shí)了在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并獲得高純度人肝素酶融合蛋白的可行性,同時(shí)用雜交瘤技術(shù),免疫制備了10株穩(wěn)定分泌人肝素酶單抗的雜交瘤細(xì)胞株,通過親和純化獲得人肝素酶單克隆抗體,為腫瘤早期轉(zhuǎn)移的MRI分子顯像研究奠定了基礎(chǔ)。

長期的研究表明,肝素酶在胚胎時(shí)期神經(jīng)、血管發(fā)育過程中起重要作用,在病理情況下參與機(jī)體的創(chuàng)傷修復(fù)、血管重建和免疫監(jiān)視等過程[9-11]。其作為一種新型的促腫瘤因子,以特有的酶解活性和非酶解活性通過多個(gè)環(huán)節(jié)、多個(gè)渠道促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。探討肝素酶在腫瘤中表達(dá)調(diào)控機(jī)制,力求從上游抑制肝素酶的表達(dá)和活性,已成為治療惡性腫瘤的新型策略之一。因此作者制備具有人肝素酶免疫識(shí)別性的雜交瘤細(xì)胞株,這為進(jìn)一步研究人肝素酶在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷以及抗體介導(dǎo)的靶向治療奠定了基礎(chǔ)。

[1]Hulett M D,Freeman C,Hamdorf B J,et al.Cloning of mammalian heparanase,an important enzyme in tumor invasion and metastasis[J].Nat Med,1999,5:803.

[2]Ilan N,Elkin M,Vlodavsky I.Regulation,function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis[J].Int J Biochem Cell Biol,2006,38(12):2018.

[3]Boyd D D,Nakajima M.Involvement of heparanase in tumor metastases:a new target in cancer therapy[J].J Natl Cancer Inst,2004,96(16):1194.

[4]Cohen I,Pappo O,EIkin M,et al.Heparanase promotes growth,angiogenesis and survival of primary breast tumors[J].Int J Cancer,2006,118(7):1609.

[5]蔡永國,房殿春,楊仕明,等.肝素酶mRNA在胃癌組織中的表達(dá)及其與 c-met表達(dá)的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(12):974.

[6]Fjeldstad K,Kolset S O.Decreasing the metastatic potential in cancers-targeting the heparin sulfate proteoglycans[J].Curr Drug Targets,2005,6(6):665.

[7]Nobuhisa T,Naomoto Y,Ohkawa T,et al.Heparaanase expression correlates with malignant potential in human colon cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2005,131(4):229.

[8]Sanderson R D,Yang Y,Kelly T,et al.Enzymatic remodeling of heparin sulfate proteoglycans within the tumor microenvironment:growth regulation and the prospect of new cancer therapies[J].J Cell Biochem,2005,96(5):897.

[9]Nathan S.Ihrcke,William Parker,Kathryn J.Reissner,et al.Regulation of platelet hepraranase during inflammation:Role of pH and proteinases[J].Journal of Cellular Physiology,1998,175(3):255.

[10]Goldshmidt O,Zeharia E,Aingorn H,et al.Expression pattern and secretion of human and chicken heparanase are determined by their signal peptide sequence[J].J Biol Chem,2001,276(31):29178.

[11]Rachel W.Li,Craig Freeman,Di Yu,et al.Hindmarsh,Kathleen E.Tymms,Christopher R.Parish,Paul N.Smith.Dramatic regulation of heparanase activity and angiogenesis gene expression in synovium from patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis&Rheumatism,2008,58(6):1590.