陳 陵,余松濤,梁光萍,湯旭東,房殿春,楊仕明

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍消化病研究所,重慶,400038;2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍燒傷研究所,重慶,400038)

在永生化細(xì)胞及癌細(xì)胞中,端粒長度維持的主要機(jī)制是端粒酶激活。端粒酶能以自身RNA為模板,延長后隨鏈模板的3′端,從而避免了由于不完全復(fù)制而導(dǎo)致的染色體DNA縮短[1]。因此,端粒酶有可能成為抗腫瘤治療的理想靶位。目前以端粒酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療已成為研究熱點(diǎn),并且在實(shí)驗(yàn)及早期臨床試驗(yàn)中取得一定效果[2-3]。但對(duì)于以旁路途徑(ALT,alternative lengthening of telomeres)延長端粒的腫瘤而言,以端粒酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療顯然無效[4]。另外,以端粒酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療對(duì)腫瘤細(xì)胞的篩選壓力是否會(huì)誘導(dǎo)或產(chǎn)生ALT途徑的激活,目前也日益受到關(guān)注[5]。因此,對(duì)ALT與端粒酶途徑機(jī)制及相互關(guān)系的研究顯得異常重要[6]。Stewart等[7]發(fā)現(xiàn)hTERT轉(zhuǎn)染并表達(dá)可促進(jìn)ALT機(jī)制延長端粒的腫瘤細(xì)胞獲得皮下成瘤能力,而在轉(zhuǎn)染前不能。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)[8],確定具有惡性表型的端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞,在進(jìn)行種植轉(zhuǎn)移模型時(shí),侵襲及轉(zhuǎn)移能力并不高;但在這些腫瘤細(xì)胞重新表達(dá)hTERT后即獲得高成瘤能力。本研究通過脂質(zhì)體法將hTERT基因修飾端粒酶陰性的人骨肉瘤U-2 OS細(xì)胞后,檢測其生物學(xué)行為及生物力學(xué)的改變,以期為研究兩種端粒延長途徑之間關(guān)系及機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

pIRES2-EGFP(本室保存),克隆有hTERT全長cDNA序列的熒光真核表達(dá)載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT,由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所梁光萍博士構(gòu)建[9]。骨肉瘤U-2 OS細(xì)胞株(北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫)。胃癌KATO Ⅲ細(xì)胞株(本室保存)。HAM′S F12液體培養(yǎng)基(Gibico BRL),G418(Amresco,OH,USA),免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中山公司),兔抗人hTERT pAb(Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)。端粒酶活性檢測試劑盒(北京鼎國)。Lipofectamine 2000(Invitrogen,CA,USA)。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham Biosciences)。Transwell小孔(Corning,NY,USA)?？扇苄约?xì)胞外基質(zhì)提取物Cultrex BME(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-hTERT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及hTERT蛋白表達(dá)檢測:采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)擴(kuò)增、提取所需質(zhì)粒。pIRES2-EGFP采用 EcoRⅠ酶切鑒定,pIRES2-EGFP-hTERT采用BamH Ⅰ酶切鑒定。凍存的U-2 OS細(xì)胞株按常規(guī)方法復(fù)蘇后,傳入Costar細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(25cm2),用HAM′S F12培養(yǎng)液加10%胎牛血清于37℃、5%CO2培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長融合至約 80%時(shí)消化傳代。參照Lipofectamine使用說明書的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并用300 μ g/mL的G418篩選克隆?？寺『Y選成功后,采用免疫組化檢測轉(zhuǎn)染 pIRES2-EGFP-hTERT后 U-2 OS細(xì)胞(U-2 OS/hTERT)hTERT蛋白的表達(dá),以轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP的U-2 OS細(xì)胞(U-2 OS/EGFP)為對(duì)照,具體操作步驟參照說明書。采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hTERT后U-2 OS細(xì)胞hTERT蛋白表達(dá),以轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP的U-2 OS細(xì)胞為對(duì)照。將收集的標(biāo)本以M-PERtm(Pierce Company)蛋白提取液分別處理細(xì)胞,收集細(xì)胞總蛋白,BCA法定量后經(jīng)SDS-PAGE電轉(zhuǎn)膜,免疫抗體反應(yīng),最后化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯帶,具體步驟按文獻(xiàn)操作[10],以GAPDH為內(nèi)參照。

1.2.2 TRAP法檢測端粒酶活性:將培養(yǎng)的U-2 OS,U-2 OS/EGFP,U-2 OS/hTERT細(xì)胞用胰酶消化后離心收集,每份樣本細(xì)胞數(shù)為5×106,各加入1 mL buffer A,混勻,4℃放置15 min。12 000 r/min,4℃離心 5 min,去上清。加入100～200 μ L buffer B,混勻,4 ℃放置30 min其間振動(dòng)數(shù)次。12 000 r/min,4℃離心15 min,棄沉淀 ,留取上清 。取2 μ L 上清,加入 20 μ L PCR液,混勻,20℃保存30 min。90℃保溫3 min。加入 1 μ L CX 引物,1 μ L Taq酶 ,2 滴石蠟油,離心數(shù)秒,按下列參數(shù)循環(huán)35輪:90℃45 s,50℃45 s,72 ℃60 s。取 15 μ L PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,進(jìn)行8%聚丙酰胺電泳,銀染觀察結(jié)果。以胃癌細(xì)胞株KATOⅢ為陽性對(duì)照。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測相對(duì)端粒長度:依照Cawthon[11]進(jìn)行的方法,檢測 3組 U2OS細(xì)胞的相對(duì)端粒長度。每個(gè)樣本端粒PCR的Ct值與36b4 PCR(用作對(duì)照的單拷貝基因)的Ct值相比,即為T/S比值。每個(gè)樣本的T/S比值,可反映相對(duì)端粒長度。兩份DNA樣本同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)。在端粒擴(kuò)增PCR反應(yīng)中,正向和反向引物分別用 270和900 nM。(正向引物:5′GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGG TGAGGGT3′, 反向引物 :5′TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA3′)。擴(kuò)增36 b4的正向和反向引物分別用300和500 nM。(正 向 引 物:5′CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC3′, 反向引物:5′CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA3′)。 PCR 反 應(yīng) 儀 采 用Corbett Research Rotor-Gene 3000 Real-time Thermal Cycler(Corbett Research,Cambridge,UK)。兩個(gè)PCR反應(yīng)均起始于95℃孵育10 min以激活Taq DNA多聚酶。隨后,擴(kuò)增端粒PCR反應(yīng)條件為95℃15 s,54℃2 min,35個(gè)循環(huán)。36 b4的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃15 s,58℃1 min,35個(gè)循環(huán)。為進(jìn)一步優(yōu)化條件,將端粒檢測和36 b4樣品在一定范圍內(nèi)倍比稀釋(200～0.02 ng DNA,10倍比稀釋)后再進(jìn)行PCR反應(yīng),在線性(R2>0.99)范圍內(nèi)進(jìn)行端粒相對(duì)長度檢測。由于相對(duì)T/S比值只有在36b4從每一樣本中等量擴(kuò)增才能正確反應(yīng)相對(duì)端粒長度,進(jìn)一步采用Q-PCR確定了36 b4與β-globin基因拷貝數(shù)相對(duì)比率。β-globin的正向引物:3′-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-5′;反向引物3′-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-5′(400 nM each)。擴(kuò)增反應(yīng)特異性采用熔解曲線檢測。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞生長周期:將培養(yǎng)的U-2OS,U-2OS/EGFP,U-2 OS/hTERT細(xì)胞用胰酶消化后離心收集,調(diào)整每份樣本細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè),離心后重懸在含100 mg/L RNA酶和10 g/L碘化丙啶的PBS中,送重慶第三軍醫(yī)大學(xué)流式細(xì)胞室檢測細(xì)胞生長周期(Counter Epics Profile II,Coulter Electronics,Inc,Hialeah,FL,USA)。結(jié)果用Cell-Quest軟件分析。

1.2.5 微允管法檢測細(xì)胞粘附能力:參照文獻(xiàn)[12-13]采用微允管技術(shù)(the vacuum micropipette aspiration technique)檢測 U-2 OS,U-2 OS/EGFP,U-2 OS/hTERT等3組細(xì)胞對(duì)人工基底膜的粘附能力。各組細(xì)胞接種于2 cm2的透明培養(yǎng)皿中。接種前,在培養(yǎng)皿底部表面覆蓋一層可溶性人基底膜提取物(Cultrex BME,R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。吸附力檢測試驗(yàn)在顯微操作儀下進(jìn)行。負(fù)壓吸引控制器產(chǎn)生5～10 mmHg的分級(jí)負(fù)壓吸引細(xì)胞。細(xì)胞剛好被吸離培養(yǎng)皿的負(fù)壓吸力即反應(yīng)其粘附能力,表示為T=×π×(Rp/Rc)2×cosθ。Rp和 Rc分別指微量吸引槍和細(xì)胞與培養(yǎng)皿粘附部份的面積。θ指微量吸引槍與培養(yǎng)皿底部的內(nèi)角。每組隨機(jī)測量25個(gè)細(xì)胞。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力的檢測:參考文獻(xiàn)[14]采用Transwell小孔遷移試驗(yàn)檢測3組細(xì)胞的侵襲能力。在侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,采用NIH-3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清作為化學(xué)趨化劑(chemoattractant)。用50 μ L濃度為1 mg/mL的基質(zhì)膠(Matrigel,BD Biosciences,NJ,USA)包被 8μ m 規(guī)格的 Transwell小孔板(Costar Transwell filter,Corning,NY,USA),培養(yǎng)基水化后將 U-2 OS,U-2 OS/EGFP,U-2 OS/hTERT等3組細(xì)胞分別接種,37℃孵育2 h。每組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后,于每個(gè)Transwell小室內(nèi)接種3×105個(gè)細(xì)胞后,將 Transwell小孔置于包 300 μ L NIH-3T3上清液及含10%胎牛血清的300 μ L McCoy′s 5a培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)。經(jīng)24 h孵箱內(nèi)培養(yǎng)后(37℃,5%CO2),小孔上部分表面用PBS清洗并用脫脂棉試子擦除未遷移細(xì)胞。95%乙醇加入Transwell小孔下部分,將細(xì)胞脫水5～10 min后,加入2 mL 1%的四溴熒光染料(tetrabromofluorescein dye),染色10～20 min后,隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

正義插入pIRES2-EGFP多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT經(jīng)Not I限制性內(nèi)切酶酶切電泳后,可見7.4+1.4 kb 2條電泳帶,與理論值一致(圖1A)。進(jìn)一步進(jìn)行測序驗(yàn)證構(gòu)建的質(zhì)粒序列正確(結(jié)果未列出)。隨后將 pIRES2-EGFP-hTERT與pIRES2-EGFP(用作空白對(duì)照)分別轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞,G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆(圖1B)。

圖1 pIRES2-EGFP及pIRES2-EGFP-hTERT酶切鑒定及轉(zhuǎn)染(A)正義hTERT表達(dá)載體質(zhì)粒(B)G418篩選轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hTERT(a)與pIRES2-EGFP(b)質(zhì)粒后的克隆

2.2 hTERT蛋白的檢測

為檢測轉(zhuǎn)染后篩選的細(xì)胞表達(dá)hTERT的水平,采用免疫組化及Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染了細(xì)胞hTERT的表達(dá),結(jié)果顯示hTERT/U2OS轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)有棕黃色陽性信號(hào),而EGFP/U2OS及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的U2OS的對(duì)照內(nèi)則未見陽性信號(hào)(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示hTERT/U2OS細(xì)胞有 120 kDa的hTERT蛋白表達(dá),而EGFP/U2OS及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的U2OS的對(duì)照內(nèi)則未見陽性信號(hào)。36 kDa的GAPDH內(nèi)參在每組中均有等量表達(dá)(圖2B)。

圖2 hTERT在各組細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 TRAP法檢測端粒酶活性及熒光定量PCR檢測相對(duì)端粒長度

采用 TRAP法檢測各組細(xì)胞端粒酶活性。結(jié)果顯示,U-2 OS與U-2 OS/EGFP均未表達(dá)端粒酶活性,而在hTERT基因修飾后,U-2 OS細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性與陽性對(duì)照的KATO Ⅲ細(xì)胞端粒酶活性相近(圖3A)。結(jié)果證實(shí)將hTERT轉(zhuǎn)染端粒酶陰性的依賴ALT機(jī)制延長端粒的腫瘤細(xì)胞后,可激活端粒酶的表達(dá)。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,hTERT/U2OS,EGFP/U2OS,U2OS的相對(duì)端粒長度分別為3.133,1.720和1.643(圖3B)。所有PCR反應(yīng)的特異性通過熔解曲線檢測(數(shù)據(jù)未列出)。36b4/β-globin拷貝數(shù)的相對(duì)比率顯示各樣本中的每個(gè)細(xì)胞36b4基因等量擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未列出)。

圖3 hTERT轉(zhuǎn)染對(duì)U2OS細(xì)胞端粒酶活性及端粒長度的影響

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期

與EGFP/U2OS及U2OS組相比,hTERT/U2OS組處于G0/G1相的細(xì)胞百分比下降,而增殖指數(shù)(proliferative index,PI)增高(表1)。這表明hTERT基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)了U2OS細(xì)胞的增殖能力。

表1 hTERT基因修飾U-2 OS細(xì)胞后細(xì)胞周期檢測結(jié)果

2.5 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力

每組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,連續(xù)7 d每天測定平均吸收率,繪制增長曲線。結(jié)果顯示,與EGFP/U2OS及U2OS組相比,hTERT/U2OS組細(xì)胞具有更高的平均吸收率(圖 4)。表明hTERT基因修飾的ALT腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。

圖4 hTERT基因修飾對(duì)U2OS細(xì)胞增殖能力的影響

2.6 Transwell小孔法檢測腫瘤細(xì)胞體外侵襲強(qiáng)度

經(jīng)過24小時(shí)細(xì)胞穿孔后,底層的細(xì)胞固定并染色。每組隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域,計(jì)數(shù)成功穿孔的細(xì)胞。結(jié)果顯示(圖5),hTERT/U2OS組細(xì)胞成功遷移數(shù)為154.8±5.2個(gè),顯著高于 EGFP/U2OS組(56.2±7.5,P<0.05)以及未轉(zhuǎn)染的U2OS組(58.4±4.2,P<0.05)。

2.7 hTERT表達(dá)對(duì)U2OS細(xì)胞在小鼠體內(nèi)侵襲能力的影響

將hTERT/U2OS,EGFP/U2OS以及未轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞從小鼠尾靜脈注射接種,1周后進(jìn)行活體熒光成像(圖6)。圖中每一個(gè)熒光亮點(diǎn)的位置代表一個(gè)小鼠肺內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。hTERT/U2OS組的轉(zhuǎn)移灶平均數(shù)顯著高于EGFP/U2OS組(20.3±1.5,7.7±1.5,P<0.001)。而U2OS組則未見熒光轉(zhuǎn)移組信號(hào)。

圖5 hTERT轉(zhuǎn)染對(duì)U2OS細(xì)胞侵襲能力的影響

圖6 接種腫瘤細(xì)胞后各組小鼠肺內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶

2.8 微允管檢測細(xì)胞粘附能力

每組隨機(jī)選取25個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測量后取均值。hTERT/U2OS組細(xì)胞平均粘附力為(967.6±102.6)×10-10N,而EGFP/U2OS與未轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞分別為(694.8±105.6)×10-10N、(707.8±74.2)×10-10N(P<0.05,圖 7B)。結(jié)果表明,hTERT基因轉(zhuǎn)染ALT機(jī)制的U2OS腫瘤細(xì)胞后,可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)ECM的粘附能力。這一改變可能在腫瘤侵襲的起始階段起到一定作用。作者進(jìn)一步進(jìn)行了侵襲試驗(yàn),檢測這一改變對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。

3 討 論

圖7 微允管法檢測hTERT基因轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞粘附能力的影響

端粒酶延長端粒的作用及機(jī)制已為人所知,但在部分永生化細(xì)胞系及腫瘤細(xì)胞中并無端粒酶激活,推測在這些細(xì)胞中可能通過端粒酶非依賴性的旁路途徑(ALT)來維持端粒長度[15]。就目前的統(tǒng)計(jì)來看,這類細(xì)胞大約占所有腫瘤細(xì)胞的10%～15%。其機(jī)制目前尚不明確,與端粒酶途徑的關(guān)系亦不清楚。Ford et al[16]認(rèn)為端粒酶途徑抑制重組途徑。也有研究結(jié)果表明,永生化的兩個(gè)途徑可在細(xì)胞內(nèi)同時(shí)起作用[17-18]。Else T等[19]也發(fā)現(xiàn),端粒酶機(jī)制在腎上腺皮質(zhì)癌(A-drenocortical cancer,ACC))中起主要作用,但部分ACC病例則表現(xiàn)出2種機(jī)制共存,或單獨(dú)依賴ALT機(jī)制延端粒。并且,端粒酶機(jī)制的ACC惡性程度高于ALT機(jī)制的ACC。作為端粒酶最為重要的亞單位,hTERT是端粒酶的限速亞單位,直接決定了端粒酶的活性。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)hTERT被抑制后,短期內(nèi)端粒的完整性不受影響,但經(jīng)過數(shù)代分裂后,染色體的穩(wěn)定性即受到干擾。而且,有研究還發(fā)現(xiàn)端粒酶可通過誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)表皮生長因子(EGFR)[20]或轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)[21]而刺激細(xì)胞增殖。在本研究中用hTERT基因修飾端粒酶陰性的U-2 OS細(xì)胞,增強(qiáng)U-2 OS細(xì)胞端粒酶表達(dá)活性后,細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。與其它表達(dá)hTERT的腫瘤細(xì)胞不同的是,U2OS細(xì)胞在不表達(dá)hTERT的情況下,仍能無限增殖。這說明通過替代途徑延長端粒的腫瘤細(xì)胞在hTERT基因修飾后,增殖能力增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞永生化的兩個(gè)途徑不僅可在U-2 OS細(xì)胞內(nèi)同時(shí)起作用,而且可能還有累加效果。但兩種途徑是獨(dú)立起作用,還是相互聯(lián)系,發(fā)揮協(xié)同作用,以及替代途徑通過何種機(jī)制發(fā)揮作用,尚有待進(jìn)一步研究。

新近研究表明,端粒酶可能促進(jìn)了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[22]。之前有研究發(fā)現(xiàn),確定具有惡性表型的端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞,在進(jìn)行種植轉(zhuǎn)移模型時(shí),侵襲及轉(zhuǎn)移能力并不高;但在這些腫瘤細(xì)胞重新表達(dá)hTERT后即獲得高成瘤能力[23]。Bagheri等進(jìn)一步研究了hTERT表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)端粒酶的活性調(diào)控著黑色素瘤的糖酵解途徑,這可能提高了腫瘤細(xì)胞的能量供給狀態(tài),從而促進(jìn)了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[24]。雖然目前已有資料支持端粒酶能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移,但其機(jī)制尚不明確。作者在本研究中利用端粒酶陰性的骨肉瘤細(xì)胞系U2OS及轉(zhuǎn)染EGFP的U2OS作為陰性對(duì)照,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)hTERT的細(xì)胞對(duì)基底膜的粘附能力明顯增強(qiáng)。為進(jìn)一步探討hTERT/U2OS細(xì)胞對(duì)基底膜粘附能力增強(qiáng)這一生物力學(xué)改變的可能結(jié)果,作者進(jìn)行了Transwell小孔遷移試驗(yàn),結(jié)果顯示 hTERT/U2OS細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。這一結(jié)果表明hTERT轉(zhuǎn)染改變了U2OS細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用能力,從而促進(jìn)了U2OS細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力?；谝陨戏治?新出現(xiàn)的問題在于端粒酶促進(jìn)U2OS細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的能力是由于延長了端粒所引起的,還是由于端粒酶本身所引起的。有研究表明,ALT介導(dǎo)的端粒延長的腫瘤細(xì)胞,其惡性程度,尤其是侵襲與轉(zhuǎn)移能力,要低于端粒酶介導(dǎo)的端粒延長的腫瘤細(xì)胞[25]。因此推測,很有可能是端粒酶本身的再激活,促進(jìn)了U2OS細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。Brachner A等[26]也發(fā)現(xiàn)端粒酶在陰性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的重激活雖不能提高腫瘤細(xì)胞染色體穩(wěn)定,但可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),其機(jī)制可能是通過端粒酶促進(jìn)了U2OS細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力。

本研究從新的角度來探討了端粒酶促進(jìn)腫瘤惡性表型的機(jī)制,以及端粒酶陰性的ALT機(jī)制延長端粒的腫瘤細(xì)胞與端粒酶的關(guān)系。ALT機(jī)制在腫瘤細(xì)胞中的激活比端粒酶的激活少見得多[27],常發(fā)生于端粒酶被抑制的選擇壓力存在時(shí)[28-29]。目前,以端粒酶為靶標(biāo)的腫瘤免疫治療是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一,但由于ALT機(jī)制的存在,腫瘤對(duì)抑制端粒酶治療的耐藥性是必須考慮的問題之一[30]。由于端粒酶表達(dá)在同一腫瘤中有所差異,針對(duì)端粒酶的腫瘤治療會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞形成選擇壓力,表達(dá)端粒酶的腫瘤細(xì)胞立即被殺傷死亡,弱表達(dá)端粒酶的腫瘤細(xì)胞亞群有可能逐步失去端粒酶表達(dá)能力。這一喪失端粒酶表達(dá)能力的腫瘤細(xì)胞亞群,大部分可能在分裂一定代次后,因端粒耗竭而死亡,但有一小部分有可能激活A(yù)LT替代端粒延伸機(jī)制,從而造成對(duì)針對(duì)端粒酶的腫瘤治療出現(xiàn)耐藥性。這一擔(dān)憂曾經(jīng)給炙手可熱的針對(duì)端粒酶的腫瘤免疫投下陰影。而本研究結(jié)果表明:沒有必要擔(dān)心這一可能的耐藥性問題,因?yàn)榧幢阍谝种贫肆Ｃ富钚灾笕绻霈F(xiàn)ALT替代機(jī)制的激活,腫瘤細(xì)胞也不可能獲得完全的惡性表型,尤其是侵襲和轉(zhuǎn)移能力不能與端粒酶陽性時(shí)相提并論,甚至完全失去侵襲與轉(zhuǎn)移的能力。

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