余松濤,楊應斌,史春夢,陳 陵,湯旭東,黎 川,師紅磊,李長珠,李 寧,王國珍,吳玉云,房殿春,楊仕明

(1.重慶第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍消化病研究所,400038;2.重慶西南大學生命科學院,400715;3.重慶第三軍醫(yī)大學預防醫(yī)學院全軍復合傷研究所,400038)

腫瘤轉移早期診斷是臨床選擇治療方式的重要依據(jù)。雖然CT、MRI和超聲技術的發(fā)展對腫瘤轉移的診斷提供了重要手段,但它們共同的缺點是不能區(qū)分影像學所見的良惡性,亦不能有效地早期發(fā)現(xiàn)轉移病灶。正電子發(fā)射CT(PETCT)是目前唯一能區(qū)分組織良惡性的影像學診斷方式,對轉移瘤的診斷明顯好于CT、MRI,但PET-CT對炎性增生還是惡性增殖病灶有時難以鑒別,而且CT、MRI和PET檢測費用昂貴。分子影像診斷一直是腫瘤轉移早期診斷的研究熱點,但最主要的問題在定性方面缺乏腫瘤的靶向性。隨著分子生物學技術的發(fā)展,人們逐漸認識到腫瘤特異性的的標志物在腫瘤的分子影像診斷中可以發(fā)揮重要作用。但目前發(fā)現(xiàn)的一些腫瘤標志物,如CEA、AFP、PSA由于特異性太高,只能作為特殊腫瘤的診斷方案而無法診斷一般腫瘤。因此有必要尋找一種腫瘤共有的標志物用于腫瘤的分子顯像。文獻及作者的研究表明,端粒酶及其催化亞單位(hTERT)在腫瘤細胞中高表達,而在體細胞中少有表達,針對hTERT的腫瘤免疫治療只殺傷腫瘤細胞,而對正常體細胞無明顯殺傷效應,提示hTERT具有良好的腫瘤靶向性[1-6]。hTERT啟動子作為限速酶的調控元件,理論上具有對腫瘤細胞的靶向調控能力[7]。本研究根據(jù)將文獻報道[8]的優(yōu)化型的hTERT啟動子克隆至一種啟動子功能檢測質粒pGL3-basic中,檢測優(yōu)化型hTERT啟動子的活性,以SV40,CMV啟動子為陽性對照,野生型hTERT啟動子為野生對照,空白無啟動子的pGL3-basic為陰性對照。隨后構建了含有優(yōu)化型hTERT啟動子或對照CMV啟動子的慢病毒表達質粒pLentihTERTp-GFP和pLenti-CMVp-GFP,并采用第3代慢病毒包裝系統(tǒng)將其重組為慢病毒顆粒。然后采用小動物熒光成像系統(tǒng)從體內及體外2個方面研究優(yōu)化型hTERT啟動子在腫瘤靶向性診斷中的作用,為臨床腫瘤靶向性分子診斷提供新的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

啟動子功能檢測實驗:啟動子功能檢測質粒pGL3-Basic獲贈于第三軍醫(yī)大學遺傳學教研室黃剛博士后。質粒瞬時轉染試劑脂質體DOTAP購于德國羅氏公司(Roche)。熒光素酶檢測試劑盒購于Promega公司。熒光素酶檢測設備采用Luminoskan Ascent(芬蘭,Thermo Labsystems公司)。

慢病毒構建:慢病毒載體質粒pLenti6/V5-DTOPO購于invitrogen公司。慢病毒包裝質粒pMDLg/pRRE,pRSV-Rev和pMD 2.G均獲贈于上海比昂生物技術有限公司。啟動子序列人工合成、所有引物合成、質粒測序均由上海英駿生物技術有限公司完成。細胞內GFP觀察采用第三軍醫(yī)大學中心實驗室德國Leica TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡。小動物活體成像采用第三軍醫(yī)大學復合傷研究所的KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System FX(美國)系統(tǒng)。

細胞株:293FT人胚腎細胞、HepG2人肝癌細胞、SGC-7901人胃癌細胞、SW480人結腸癌細胞、A375人惡性黑素瘤細胞、U2OS和 SaoS-2人骨肉瘤細胞均購于上海中科院細胞所,原代培養(yǎng)的人胚胎成纖維細胞HF獲贈于第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院燒傷研究所梁光萍博士?；蚪MDNA純化試劑盒購于QIAGEN公司。細胞培養(yǎng)基RPMI 164、DMEM、小牛血清和胎牛血清購于Hy-Clone公司。hTERT一抗購于 Santa Cruz(美國),GFP一抗購于中杉金橋(中國北京)。

1.2 各株細胞內端粒酶催化亞單位的表達檢測

采用免疫組化和 western blot方法檢測hTERT在各株細胞內的表達。方法見文獻[3]和[9]。

1.3 啟動子序列設計,人工合成及功能檢測

1.3.1 啟動子序列設計,人工合成:根據(jù)文獻報道全基因合成優(yōu)化型的hTERT啟動子,該啟動子保留了野生型hTERT啟動子的核心序列,并在其中插入3個Myc家族調控因子的結合位點E-box(CACGTG)[8],以增強啟動子在腫瘤細胞內被Myc上調其功能的潛力。優(yōu)化后啟動子長度為295 bp,被全基因合成至pUC57質粒上,同時在兩端合成酶切位點ClaⅠ和BamH Ⅰ以便插入慢病毒載體質粒。

1.3.2 啟動子功能檢測質粒pGL3-hTERTp,pGL3-CMVp的構建:pGL-hTERTp質粒構建:設計引物上游 3′cttgagctcccgatacgcatcgatcacag5′,下游 3′gccagatcttacctcgcgaatgcatctag5′,從 pUC57質粒上PCR擴增hTERT啟動子片段,上下游引物分別含有相應酶切位點BglⅡ和SacⅠ,以便酶切后插入pGL-Basic質粒中的啟動子位置。然后將pGL-Basic用BglⅡ和SacⅠ雙酶切后獲得線性片段。再將PCR擴增產物hTERT啟動子片段鏈接進入線性片段,獲得pGL-hTERTp質粒。

pGL-CMVp質粒構建:設計引物上游 3′cgactcgagagttccgcgttacataactt-5′,下游 3′gctaagctt tcggtgtcttctatggaggt-5′,從 pLenti6/V5-D-TOPO質粒上PCR擴增CMV啟動子片段,上下游引物分別含有相應酶切位點XhoⅠ和HindⅢ,以便酶切后插入pGL-Basic質粒中的啟動子位置。然后將pGL-Basic用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后獲得線性片段。再將PCR擴增產物CMV啟動子片段鏈接進入線性片段,獲得pGL-CMVp質粒。

1.3.3 質粒轉染和熒光素酶檢測:用DOTAP法將 pGL3-hTERTp、pGL3-CMVp、pGL3-SV40p(Promega公司附贈的陽性對照質粒)、pGL3-Basic(含空白啟動子位置,作為陰性對照)、pGL3-hTERTp(original)(含野生型hTERT啟動子,作為野生對照,西南醫(yī)院燒傷所梁光萍博士贈送)五株質粒分別轉染以上8株細胞。轉染72 h候提取蛋白,按照Promega公司提供的的操作程序做標準的熒光素酶檢測。

1.4 慢病毒構建和最優(yōu)感染倍數(shù)的測定

1.4.1 慢病毒載體質粒pLenti-hTERTp-GFP,pLenti-CMVp-GFP的構建:本實驗采用第3代慢病毒真核表達載體質粒pLenti6/V5 TOPO作為慢病毒載體骨架質粒。用Bam H 1和Cla 1(BspD 1的同工酶)將pLenti6/V5 TOPO內的CMV啟動子切掉,將pUC57中的 hTERT啟動子也用Bam H 1和Cla 1切下并連接入線性pLenti6/V5 TOPO內,命名為 pLenti-hTERTp-GFP。將pLenti6/V5 TOPO本身改名為pLenti-CMVp-GFP,作為啟動子功能對照的慢病毒質粒。作者采用四質粒慢病毒包裝系統(tǒng),將三個包裝質粒pMDLg/pRRE,pRSV-Rev和pMD2.G用DOTAP共轉染法與載體質粒pLenti-hTERTp-GFP或pLenti-CMVp-GFP共轉染至293FT細胞內。轉染72 h后收集病毒上清,0.22 μ m針式濾器過濾,并采用超速離心法濃縮病毒100倍。

1.4.2 慢病毒滴度檢測:本實驗采用 RT-PCR法測定載體中特征WPRE序列以檢測病毒滴度。24孔平板培養(yǎng)Hela細胞,每孔細胞量5×104,將系列稀釋后的病毒顆粒分別加入24-well培養(yǎng)板,72 h后,用基因組DNA純化試劑盒(QIAGEN)提取病毒轉導的Hela細胞基因組。real time PCR的WPRE序列引物為上游(1277F):ccgtttcaggcaacgtg;下游(1361R):agctgacaggtggt ggcaat;探針(1314P):FAM-tgctgacgcaacccccact ggt-TAMRA。β-actin序列引物上游:gcgagaagatgacccagctc;下游:ccagtggtacggccagagg;探針:FAM-ccagccatgtacgttgctatccaggc-TAMRA。實時定量PCR采用通用型一步法試劑universal PCR master mix(Promega)。

1.4.3 慢病毒最佳感染倍數(shù)的確定:為了確定慢病毒對細胞的最佳感染倍數(shù)(multiplicity of infection,MOI)和感染時間 ,將2株病毒分別以1 MOI和2 MOI的倍數(shù)感染96孔板內的293FT細胞 。分別在感染后 2、12、24、48、72 h 觀察其GFP表達情況。以研究其最適合的感染倍數(shù)和轉基因表達時間。

1.5 慢病毒體外感染端粒酶陽性及端粒酶陰性細胞株,以研究其對端粒酶陽性細胞的特異性顯像

將慢病毒 Lenti-hTERTp-GFP和 Lenti-CMVp-GFP以2 MOI的感染倍數(shù)感染293 FT,HepG2,SGC-7901,SW480,A375U2OS,SaoS2,HF。在感染后72 h和40 d時分別用激光共聚焦顯微鏡對細胞內GFP的表達進行觀察和拍照。以觀察慢病毒Lenti-hTERTp-GFP在端粒酶陽性細胞內是否能夠特異性長時表達GFP。

1.6 慢病毒感染荷瘤裸鼠,以研究其對端粒酶陽性腫瘤的特異性、實時無創(chuàng)的顯像

在本實驗中,首先構建了荷瘤裸鼠模型。將15只3周齡的BALB/c裸鼠分為5組,每組3只。在每組裸鼠的雙側臀部皮下種植腫瘤細胞。5組分別種 植 HepG2、SGC-7901、SW480、U2OS、SaoS2腫瘤細胞。各組腫瘤細胞種植量均為1×106個/部位。10 d后,將慢病毒 Lenti-hTERTp-GFP以8×106TU/部位瘤內注射至所有裸鼠的左側腫瘤內。將慢病毒Lenti-CMVp-GFP以8×106T U/部位瘤內注射至所有裸鼠的右側腫瘤內。病毒注射后第24小時和第30天分別在小動物活體熒光成像系統(tǒng)(KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System FX,美國)下觀察腫瘤內GFP的表達。以確定慢病毒Lenti-hTERTp-GFP對端粒酶陽性腫瘤的特異性活體成像功能。同時觀察其報告基因在活體狀態(tài)下的表達時間。

病毒注射30 d后,處死裸鼠并剝離腫瘤,做HE切片染色。免疫組化實驗檢測每塊腫瘤切片內GFP蛋白的表達。

2 結 果

2.1 各株細胞內端粒酶催化亞單位的表達檢測

免疫組化實驗和western blot實驗檢測各株細胞內hTERT的表達,發(fā)現(xiàn)293FT、HepG2、SGC-7901、SW480、A375 5株細胞為 hTERT 陽性,而U2OS、SaoS2、HF 3株細胞為 hTERT 陰性(圖1)。

圖1 免疫組化和Western blot檢測hTERT在8株細胞中的表達 ×200

2.2 啟動子功能檢測質粒pGL3-hTERTp,pGL3-CMVp的構建

用相應的內切酶對 pGL-hTERTp和 pGLCMVp質粒進行酶切鑒定和測序鑒定。其電泳結果(圖2)和測序結果(圖略)均證實各片段正確插入。

圖2 pGL-hTERTp和pGL-CMVp質粒酶切鑒定

2.3 熒光素酶檢測結果

Luciferase檢測結果:我們對八株細胞轉染各質粒后測得的熒光素酶強度做直方圖分析(圖3)。發(fā)現(xiàn)在3株端粒酶陰性的細胞中,轉染了pGL-hTERTp和pGL-hTERTp(original)質粒的細胞和轉染了陰性對照質粒pGL-Basic的細胞具有相同的熒光素酶強度,均趨近于零。而轉染了陽性對照質粒pGL-CMVp和pGL-SV40p的細胞均具有很強的熒光素酶強度,介于 50-100(圖3A)。在五株端粒酶陽性腫瘤細胞株內,轉染了pGL-hTERTp和pGL-hTERTp(original)質粒的細胞和轉染了陽性對照質粒pGL-CMVp和pGLSV40p的細胞具有相同的熒光素酶強度,均位于50～120;同時 pGL-hTERTp組較之 pGL-hTERTp(original)組的熒光素酶強度稍高(圖3B)。該結果證實了采用的優(yōu)化型hTERT啟動子能夠在端粒酶陽性細胞中特異性啟動報告基因的表達?？梢杂糜谀[瘤體特性活體光學成像。

圖3 雙熒光素酶試驗檢測優(yōu)化型hTERT啟動子的功能

2.4 慢病毒構建、滴度檢測和最優(yōu)感染倍數(shù)的選定

用相應的內切酶分別酶切鑒定pLentihTERTp-GFP和pLenti-CMVp-GFP質粒,證實了hTERT或CMV啟動子和GFP的正確長度(圖4)。并同時進行了測序鑒定(圖略)。

將PCR測得的WPRE序列拷貝數(shù)代入公式Tu/mL=(wpre/β-actin)×細胞數(shù) ×1 000 μ L/mL×稀釋倍數(shù),計算得出 Lenti-hTERTp-GFP滴度為2.75×108T U/mL,Lenti-CMVp-GFP滴度為3.6×108TU/mL。在 1MOI和2MOI病毒感染后的 293FT 細胞中,感染后 2、12、24 、48 、72 h 的EGFP表達情況被激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照(圖5),證實2MOI的為最佳感染倍數(shù)。

圖4 酶切鑒定pLenti-hTERTp-GFP和pLenti-CMVp-GFP質粒

圖5 病毒最佳感染倍數(shù)(MOI)測定 ×100

2.5 慢病毒體外感染細胞后,對端粒酶陽性細胞的特異性顯像

在病毒感染后72 h,觀察發(fā)現(xiàn) LentihTERTp-GFP感染的端粒酶陽性細胞內均有GFP表達,而端粒酶陰性細胞內無GFP表達;對照慢病毒Lenti-CMVp-GFP感染的端粒酶陽性和陰性細胞內均有GFP表達。證實了含有hTERT啟動子的慢病毒Lenti-hTERTp-GFP具有在端粒酶陽性細胞內特異表達報告基因的能力。在感染后第40天拍照發(fā)現(xiàn),Lenti-hTERTp-GFP感染后的端粒酶陰性細胞內仍然無GFP表達,而端粒酶陽性細胞的GFP表達豐度無衰減(圖6)。進一步證實了該慢病毒的端粒酶特異性,同時證實該慢病毒具有較高的目的基因整合效率,從而達到長時表達報告基因GFP。

2.6 慢病毒感染荷瘤裸鼠后,對端粒酶陽性腫瘤的特異性、實時無創(chuàng)顯像

在病毒注射后第 24小時,Lenti-hTERTp-GFP感染后的端粒酶陽性腫瘤均能在活體成像系統(tǒng)下被觀察到,而感染了Lenti-hTERTp-GFP的端粒酶陰性腫瘤不能被觀察到。同時,對照病毒Lenti-CMVp-GFP感染后的所有端粒酶陽性和陰性的腫瘤均能被觀察到(圖7 A)。說明慢病毒Lenti-hTERTp-GFP能夠在端粒酶陽性腫瘤細胞內特異表達GFP并在活體成像系統(tǒng)下實現(xiàn)對腫瘤進行特異性的整體水平無創(chuàng)觀察。第30天的活體成像觀察結果發(fā)現(xiàn)各個腫瘤范圍均有明顯擴大,而Lenti-hTERTp-GFP感染后的腫瘤仍然只有端粒酶陽性腫瘤有GFP表達,且表達強度和范圍均有大幅增加。而端粒酶陰性腫瘤內仍然沒有GFP表達(圖7 B)。說明 Lenti-hTERTp-GFP能夠實現(xiàn)對端粒酶陽性腫瘤進行長時的活體成像。剝離腫瘤的HE染色證實其腫瘤細胞的特殊形態(tài)(圖 8A)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)感染了 LentihTERTp-GFP的端粒酶陰性腫瘤內無GFP蛋白的表達,其余腫瘤均有GFP蛋白的表達(圖8B)。進一步證實了Lenti-hTERTp-GFP慢病毒具有端粒酶特異性。

圖6 慢病毒體外感染八株細胞后對端粒酶陽性細胞的特異性顯像(200倍)

圖7 慢病毒活體感染荷瘤裸鼠后對端粒酶陽性腫瘤的特異性顯像。左側為活體熒光圖像,右側為同一體位下的白光圖像,所有裸鼠左側腫瘤均注射Lenti-hTERTp-GFP、右側腫瘤均注射Lenti-CMVp-GFP。

圖8 慢病毒感染活體腫瘤后GFP蛋白的表達

3 討 論

活體生物體內光學成像(optical in vivo imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)2種技術。生物發(fā)光是用熒光素酶(luciferase)基因標記細胞或DNA,而熒光技術則采用熒光報告基團(GFP、RFP)進行標記,利用報告基因產生的生物發(fā)光、熒光蛋白質或染料產生的熒光就可以形成體內的生物光源。兩者的主要區(qū)別在于前者是動物體內的自發(fā)熒光,不需要激發(fā)光源;而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)。雖然哺乳動物組織是不透光的,但是利用靈敏的光子成像技術可以從動物體表檢測到組織內部的生物光源?；铙w生物光學成像由敏感的熒光照相機(charge coupled device camera,CCD camera)及其分析軟件和作為報告子的熒光素酶/熒光素或熒光蛋白組成。報告基因可以被插入多種基因的啟動子之后,通過監(jiān)測報告基因的表達情況,從而實現(xiàn)對靶細胞或靶分子表達的實時監(jiān)測[10-11]。

活體生物體內光學成像技術具有以下優(yōu)點[10-11]:①無創(chuàng)性:與傳統(tǒng)的將實驗動物處死后再進行組織染色、酶活性分析的方法相比具有巨大的優(yōu)勢;②可以在不同時相點多次重復:這樣可在同一動物體內獲得全部時相點的全部數(shù)據(jù),既節(jié)省了實驗動物,又節(jié)省了時間以及實驗經費,更重要的是避免了不同實驗動物之間的個體差異以及傳統(tǒng)檢測方法誤差所造成的對實驗結果的影響;③快速實時掃描成像;④可以使實驗動物整體活體成像;⑤敏感性高:有學者報告活體生物光學成像技術檢測腫瘤細胞的敏感性甚至超過了流式細胞儀體外檢測的敏感性[12];⑥毒副作用小:與其他用于檢測細胞游走增殖的標記技術如熒光染料、放射性探針等相比,活體生物光學成像技術對靶細胞無毒副作用,并且也不會因為靶細胞增殖分裂,信號稀釋而喪失標記作用。

借助活體生物光學成像技術實時監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展的病理生理過程是當前西方發(fā)達國家一個非常重要、發(fā)展非常迅速的前沿研究領域。它可以直接快速地觀察各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉移,并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估[13]?；铙w生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤及自發(fā)瘤[14-16]。目前的生物成像技術提高了檢測的靈敏度,即使微小的轉移灶也能被檢測到(可以檢測到體內100個細胞的微轉移)[12]。

基于以上分析,作者利用文獻報道的合成優(yōu)化的hTERT啟動子序列[8],將優(yōu)化后的hTERT啟動子全基因克隆到一種啟動子功能檢測質粒pGL3-basic中,以熒光素酶作為報告基因,對啟動子的功能進行量化檢測并分析。實驗結果顯示優(yōu)化型hTERT啟動子只在端粒酶陽性的腫瘤細胞內表達熒光素酶,而在所有端粒酶陰性的細胞內不表達熒光素酶。同時,陽性對照啟動子SV40,CMV啟動子在所有細胞內均能表達熒光素酶,而陰性對照組(無啟動子的pGL3-basic質粒)在所有細胞內均不能表達熒光素酶。說明優(yōu)化型hTERT啟動子具有嚴格的端粒酶特異行。而且,結果顯示在端粒酶陽性細胞內,優(yōu)化型hTERT啟動子的功能還略高于野生型hTERT啟動子的功能,顯示優(yōu)化后的啟動子不僅片段長度大大減小,降低了被其他因素調控的概率,而且由于添加了E-box而增強了其在腫瘤細胞內的功能。是一種理想的腫瘤特異性啟動子。

本實驗進一步采用的第3代慢病毒基因轉移系統(tǒng),研究了hTERT靶向性在腫瘤實時活體成像中的作用。比較腺病毒而言,該系統(tǒng)具有多種優(yōu)點[17-19]。能夠感染靜止細胞如腫瘤干細胞等;能夠將目的基因整合至宿主細胞基因組從而達到長期表達的目的;較之第2代慢病毒,第3代包裝系統(tǒng)具有更高的生物安全性和更高的產物滴度[20]。RT-PCR檢測證實獲得的病毒滴度高達108級,而且該慢病毒在2 MOI的感染倍數(shù)就能夠達到較高的感染效率,這些結果均顯示該病毒能夠滿足體外及在體實驗的要求。本研究結果顯示,含hTERT啟動子的慢性病毒能夠在端粒酶陽性細胞內特異性地表達GFP蛋白,而在端粒酶陰性細胞內不表達GFP。同時,GFP表達時間長達40 d之久,表明該病毒不僅具有嚴格的端粒酶特異性,而且能夠整合至宿主細胞基因組,長時表達目的基因。在體內實驗中,含優(yōu)化型hTERT啟動子和報告基因GFP的慢病毒能夠通過瘤內注射的方式感染活體腫瘤,在端粒酶陽性腫瘤細胞內特異性表達GFP,并且在小動物活體成像系統(tǒng)內實時無創(chuàng)的檢測到熒光信號。從而研究腫瘤細胞的生長模式、轉移模式以及其他生物學行為。在該活體顯像模型中,hTERT靶向的慢病毒感染后,hTERT陽性腫瘤細胞內熒光信號隨著腫瘤生長而范圍增大,熒光強度升高,將有可能成為一種很有潛力的腫瘤診斷和示蹤工具。

[1]楊仕明,房殿春,羅元輝,魯 榮,劉為紋.胃癌及癌前組織端粒酶活性及其臨床意義[J].中華醫(yī)學雜志,1998,3:207.

[2]陳 陵,陳 婷,蔡永國,等.胃粘膜癌變過程中hTERT和相關基因表達的變化及其臨床意義[J].胃腸病學和肝病學雜志,2006,15(5):443.

[3]Yang S M,Fang D C,Yang J L,et al.Antisense human telomerase reverse transcriptase could partially reverse malignant phenotypes of gastric carcinoma cell line in vitro[J].Eur J Cancer Prev,2008,17(3):209.

[4]Chen L,Liang G P,Tang X D,et al.In vitro anti-tumor immune response induced by dendritic cells transfected with hT ERT recombinant adenovirus[J].Biochem Biophy Res Commun,2006,351:927.

[5]Chen L,Tang X D,Yu S T,et al.Induction of anti-tumor immunity by dendritic cells transduced with hT ERT recombinant adenovirus in mice[J].J Pathol,2009,217:685.

[6]Harley C B.Telomerase and cancer therapeutics[J].Nat Rev,2008,8:167.

[7]Kelland L.Targeting the limitless replicative potential of cancer:the telomerase/telomere pathway[J].Clin Cancer Res,2007,13:4960.

[8]蘇長青,王星華,崔貞福,等.腫瘤端粒酶靶向腺病毒載體的表達活性[J].實用癌癥雜志,2004,19(5):449.

[9]Yu S T,Chen L,Wang H J,et al.hTERT promotes the invasion of telomerase-negative tumor cells in vitro[J].Int J Oncol,2009,35:329.

[10]Luker G D,Luker K E.Optical imaging:current applications and future directions[J].J Nucl Med,2008,49(1):1.

[11]Wang G,Cong W,Shen H,et al.Overview of bioluminescence tomography--a new molecular imaging modality[J].Front Biosci,2008,13:1281.

[12]Edinger M,Cao Y,Vemeris M R,et al.Revealing lymphoma growth and the efficacy of immune cell therapies using in vivo bioluminescence imaging[J].Blood,2003,101:640.

[13]Hoffman R M.The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo[J].Nature,2005,5:796.

[14]Morizono K,Xie Y,Ringpis G E,et al.Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection[J].Nat Med,2005,11:346.

[15]Garcia T,Jackson A,Bachelier R,et al.A convenient clinically relevant model of human breast cancer bone metastasis[J].Clin Exp Metastasis,2008,25(1):33.

[16]Liao C P,Zhong C,Saribekyan G,et al.Mouse models of prostate adenocarcinoma with the capacity to monitor spontaneous carcinogenesis by bioluminescence or fluorescence[J].Cancer Res,2007,67(15):7525.

[17]al Yacoub N,Romanowska M,Haritonova N,Foerster J:Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts[J].J Gene Med,2007,9:579.

[18]Dishart K L,Denby L,George S J,et al.Third-generation lentivirus vectors efficiently transduce and phenotypically modify vascular cells:implications for gene therapy[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35:739.

[19]Naldini L,Blomer U,Gallay P,et al.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J].Science,1996,272:263.

[20]Dull T,Zufferey R,Kelly M,et al.A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system[J].J Virol,1998,72:8463.