陳菲菲,朱曉芳,高 慧,駱 丹

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇南京,210009;2.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科,江蘇揚(yáng)州,225001)

接觸性皮炎屬于與Ⅳ型變態(tài)反應(yīng),在其發(fā)病過(guò)程中,多種細(xì)胞因子、朗格漢斯細(xì)胞的活化、移動(dòng)和抗原的提呈及免疫反應(yīng)起到了重要的作用,其中TNF-α是主要的細(xì)胞因子,CD1a是朗格漢斯細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,皮膚免疫反應(yīng)的啟動(dòng)與轉(zhuǎn)錄因子Rel/NF-κ B激活密切相關(guān)。白芍總苷是從毫白芍干燥根中提取的有效成分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明它具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)等作用[1]。本研究用2,4-二硝基氟苯(DNFB)誘發(fā)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)模型,觀察白芍總苷對(duì)小鼠ACD的作用,通過(guò)檢測(cè)耳腫度、細(xì)胞因子 TNF-α和免疫組化NF-κ Bp65、CD1a表達(dá)水平,探討白芍總苷對(duì)小鼠ACD的作用和可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)用小鼠為揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供的昆明小鼠32只,雌雄各半,6～8周齡,體質(zhì)量25～30 g。全部小鼠隨機(jī)分為4組,分別為空白組、模型組、地塞米松組和白芍總苷組,每組8只。其中空白組未做任何處理。

1.2 主要試劑

DNFB購(gòu)于Sigma公司,白芍總苷(帕夫林)由寧波立華制藥公司提供,地塞米松片由浙江仙琚制藥股份有限公司提供,TNF-α ELISA試劑盒及NF-κ B、CD1a免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立小鼠ACD模型:DNFB以4∶1體積比的丙酮與橄欖油混合液為基質(zhì),配成0.2%、0.5%的2種溶液。所有小鼠于實(shí)驗(yàn)前1 d在腹部備皮2 cm×1.5 cm。實(shí)驗(yàn)第1、2天在腹部去毛部位均勻涂布0.5%的25 μ L DNFB溶液致敏。實(shí)驗(yàn)第6天在小鼠的左耳腹、耳背面涂布0.2%的20μ L DNFB溶液誘發(fā)皮炎。右耳涂布 20 μ L基質(zhì)[2]。

1.3.2 給藥方法:白芍總苷組每只小鼠用藥量為1 8mg/d(小鼠用藥量為成人用量20倍),溶于0.5%羧甲基纖維素溶液中,每日取0.4 mL灌胃。地塞米松組每只小鼠用藥量為0.09 mg/d(按成人每天地塞米松9 mg,小鼠用藥量為20倍),溶于0.5%羧甲基纖維素溶液中,每日取0.4 mL灌胃。模型組予以生理鹽水灌胃。致敏期各組自第1次涂藥前2 h開(kāi)始,連續(xù)用藥5 d,誘發(fā)期灌藥為誘發(fā)前2 h及誘發(fā)后6 h。所有小鼠誘發(fā)后24 h處死。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 耳厚度差:千分尺測(cè)量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度,計(jì)算誘發(fā)后左右耳厚度差。

1.4.2 HE染色及觀察:取鼠耳組織常規(guī)石蠟切片,HE染色。觀察各組的病理變化。

1.4.3 小鼠左耳皮損處組織免疫組化(SABC):觀察NF-κ Bp65、CD1a的表達(dá)。切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,熱修復(fù)抗原,滴加5%BSA封閉液,然后依次加入一抗、生物素化二抗,SABC后,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。

1.4.4 血清TNF-α檢測(cè):小鼠處死時(shí)采用眼球摘除法取血約1.5 mL,靜置15 min后,3 000 r/min離心15 min,分離血清,置于-20℃冰箱中待檢,采用ELISA法測(cè)定血清中細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)水平。具體操作按試劑盒說(shuō)明。用酶標(biāo)儀測(cè)定各標(biāo)本450 nm處OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出各樣品TNF-α的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠耳厚度的變化

肉眼觀察,模型組小鼠左耳腫脹、充血,可見(jiàn)耳部血管擴(kuò)張。地塞米松組及白芍總苷組小鼠左耳腫脹不明顯,無(wú)明顯充血。與模型組相比地塞米松組及白芍總苷組誘發(fā)后左右耳厚度差明顯減小。結(jié)果表明,地塞米松及白芍總苷能有效改善耳腫脹情況。見(jiàn)表1。

表1 白芍總苷對(duì)ACD小鼠耳厚度差的影響( ±s,×10-3mm)

表1 白芍總苷對(duì)ACD小鼠耳厚度差的影響( ±s,×10-3mm)

與模型組比較,＊P<0.05。

組別 n 耳厚度差(左-右)空白組 8 5.425±0.537＊模型組 8 39.200±11.519白芍總苷組 8 12.000±1.000＊地塞米松組 8 10.333±2.082＊

2.2 各組組織病理學(xué)觀察

模型組HE染色切片可見(jiàn):表皮顯示細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)水腫,能發(fā)現(xiàn)較多的單一核細(xì)胞及少數(shù)多形核細(xì)胞的浸潤(rùn)。真皮結(jié)締組織水腫,血管周圍可見(jiàn)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。地塞米松組及白芍總苷組HE染色切片可見(jiàn)水腫消退,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各種處理因素對(duì)小鼠耳組織影響 HE染色,100倍

2.3 各組免疫組化檢測(cè)結(jié)果

NF-κ B p65在ACD皮損角質(zhì)形成細(xì)胞核周和胞漿表達(dá),胞漿及部分胞核可見(jiàn)棕黃色顆粒沉著。白芍總苷組及地塞米松組NF-κ B p65表達(dá)明顯減少甚至消失,空白組未見(jiàn)NF-κ B p65表達(dá)。見(jiàn)圖2。CD1a在模型組中可見(jiàn)棕黃色深染的顆粒,在地塞米松組及白芍總苷表達(dá)組明顯減少,空白組未見(jiàn)明顯表達(dá)。見(jiàn)圖3。

2.4 各組 TNF-α的變化(表2)

表2 各組小鼠血清中TNF-α測(cè)定( ±s,pg/mL)

表2 各組小鼠血清中TNF-α測(cè)定( ±s,pg/mL)

與模型組比較,＊P<0.05。

組別 n T NF-α空白組 8 1.865±0.492＊模型組 8 14.207±0.712白芍總苷組 8 8.000±0.497＊地塞米松組 8 6.332±0.848＊

3 討 論

ACD是皮膚或粘膜接觸致敏物后,由T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)引起的炎癥性皮膚病。其中朗格漢斯細(xì)胞抗原的提呈功能起到重要的作用,CD1a是朗格漢斯細(xì)胞的標(biāo)記性抗體。

角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)是參與皮膚免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞之一。各種刺激可使KC合成或產(chǎn)生多種生物活性分子如細(xì)胞因子及抗微生物多肽等,參與皮膚的免疫反應(yīng),而這一反應(yīng)的啟動(dòng)與轉(zhuǎn)錄因子 Rel/NF-κ B 激活密切相關(guān)[3]。核因子-κ B(NF-κ B)是細(xì)胞中一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子。多種刺激通過(guò)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終激活NF-κ B。NF-κ B出在免疫以及炎癥反應(yīng)中起著相當(dāng)關(guān)鍵的作用[4]。激活的NF-κ B可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的多種炎癥相關(guān)基因表達(dá)[3,5]、炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、趨化因子、協(xié)同刺激分子及粘附分子等表達(dá),進(jìn)而參與免疫炎癥反應(yīng)調(diào)控。研究證實(shí),NF-κ B的活化在炎癥過(guò)程中扮演了關(guān)鍵性角色,其活化后可啟動(dòng)多種促炎癥基因的轉(zhuǎn)錄,如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)加氧酶-2(COX-2)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等[6]。

ACD主要由Th1型細(xì)胞介導(dǎo),而Th2型細(xì)胞可能參與ACD的調(diào)節(jié)過(guò)程。Th1細(xì)胞主要分泌 TNF-α、IFN-γ、IL-2 等 ,而其中 TNF-α在 ACD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。作為重要的炎癥前介質(zhì),TNF-α可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生、粘附分子和協(xié)同刺激因子的表達(dá)。Kataranovski等報(bào)告在ACD小鼠鼠耳皮膚培養(yǎng)液中TNF-α水平與耳腫脹度成正相關(guān)[8],同時(shí)TNF-α為朗格漢斯細(xì)胞移行至淋巴結(jié)提供重要的信號(hào)[9]。腫瘤壞死因子TNF-α對(duì)朗格漢斯細(xì)胞的活化、移動(dòng)和抗原的提呈起重要作用[10]。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí),芍藥中的苷類物質(zhì)(芍藥總苷,TGP)是芍藥的主要有效成份,可抑制大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α,IL-1β,IL-2,NO,產(chǎn)生抗炎作用[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示,通過(guò)耳腫脹度及組織病理的變化,可以證明白芍總苷對(duì)小鼠接觸性皮炎有明顯的治療作用。白芍總苷能明顯降低血清中細(xì)胞因子TNF-α的水平,也明顯下調(diào)了皮損組織中NF-κ Bp65、CD1a的表達(dá)。白芍總苷對(duì)小鼠接觸性皮炎的免疫調(diào)節(jié)作用除了直接抑制Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子 TNF-α表達(dá)外,并且能減少CD1a的表達(dá),即對(duì)朗格漢斯細(xì)胞的抗原遞呈功能起抑制作用。還可能通過(guò)直接或間接抑制KC轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B的活化,從而進(jìn)一步抑制NF-κ B調(diào)控的促炎細(xì)胞因子,從而對(duì)ACD起到治療作用。

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