彭繼明，張佑紅，徐 鵬，陳 林，馬 靜，危 威

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

絲氨酸是人體中物質(zhì)代謝、生理活動(dòng)、抵抗疾病必不可少的物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、化妝品中有廣泛的應(yīng)用.絲氨酸含量的變化不僅可以為疾病的診斷、治療效果的觀察提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)及資料，還是檢驗(yàn)食品和化妝品是否合格的重要標(biāo)準(zhǔn)，因此準(zhǔn)確測(cè)定絲氨酸含量具有極其重要的意義[1-5].測(cè)定絲氨酸量的方法有高效液相色譜法[6]，氨基酸自動(dòng)分析儀法[7-10]，但二者需要較貴重的儀器設(shè)備且操作步驟復(fù)雜.已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，用分光光度法測(cè)定絲氨酸的含量，準(zhǔn)確率極高，與氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)的含量的誤差在2%以內(nèi)[11].因此，氨基酸與茚三酮反應(yīng)在臨床檢驗(yàn)、衛(wèi)生分析、食品工業(yè)和藥品檢驗(yàn)等方面被廣泛采用，在蛋白質(zhì)合成和結(jié)構(gòu)鑒定中也常用來(lái)完成定性和定量測(cè)定[12-14].該反應(yīng)受多種因素的影響，主要有：反應(yīng)pH值、顯色劑含量、反應(yīng)時(shí)間、溫度、氨基酸種類等[15-18].關(guān)于反應(yīng)的最佳pH值的報(bào)道有很多，但觀點(diǎn)并不一致，從pH值4.0～9.0為最佳均有報(bào)道[19-20].

在實(shí)際應(yīng)用的反應(yīng)體系中，基于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，準(zhǔn)確測(cè)定絲氨酸的含量時(shí)，不宜加入過(guò)多的酸或堿調(diào)節(jié)pH值(因?yàn)榧尤胨峄驂A引起的體積變化，會(huì)導(dǎo)致絲氨酸濃度發(fā)生較大變化).研究絲氨酸磷脂制備體系中的絲氨酸含量時(shí)，體系存在以下幾個(gè)特點(diǎn)：a.絲氨酸與茚三酮反應(yīng)，在處于文獻(xiàn)報(bào)道的緩沖溶液最佳pH值時(shí)，磷脂酶D的活性有可能喪失(當(dāng)pH為4.0～7.0時(shí)，磷脂酶D有活性.b.在酸性、堿性和中性環(huán)境中，絲氨酸與茚三酮反應(yīng)的機(jī)理不同，生成的有色物質(zhì)也不相同.c.為了研究酶的動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)在pH值分別為4.5，5.0，5.5，6.0，7.0的緩沖液中進(jìn)行，緩沖液的pH值難以調(diào)至文獻(xiàn)報(bào)道的絲氨酸與茚三酮反應(yīng)的pH值.d.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中測(cè)定最佳反應(yīng)時(shí)間和酶量時(shí)，需連續(xù)取樣，每次取樣量為0.2 mL(取樣量較小)，加入酸堿調(diào)節(jié)pH值至最佳，容易引起較大的誤差.為了獲得磷脂酶D在絲氨酸磷脂制備體系中的最佳pH值，需要得到絲氨酸在幾種不同pH值下的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

本實(shí)驗(yàn)采用茚三酮顯色法，測(cè)定了絲氨酸與茚三酮反應(yīng)的最佳時(shí)間和相對(duì)用量，并確定絲氨酸在pH值分別為4.5，5.0和6.0時(shí)的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑:卵磷脂(優(yōu)級(jí)純)，絲氨酸(優(yōu)級(jí)純), 南京奧多福尼生物科技有限公司生產(chǎn)；磷脂酶D(優(yōu)級(jí)純)，Streptomyces Sp.Glycerophospholipid specific； 茚三酮 (分析純)，氯化亞錫 (分析純), 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司生產(chǎn)； 其他試劑均為分析純?cè)噭﹥x器：HH-S型恒溫水浴鍋，上海東璽制冷儀器有限公司生產(chǎn)；Mk3酶標(biāo)儀， BCD-251FBNW超低溫冰箱，上海熱電儀器有限公司生產(chǎn)；PB-10pH測(cè)定儀，北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)；AL204型電子天平，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

α—氨基酸在弱酸性溶液中與茚三酮共熱，引起氨基酸氧化脫氨、脫羧反應(yīng)，最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物—氨和還原茚三酮發(fā)生作用，生成紫色物質(zhì)，用分光光度法測(cè)定反應(yīng)后溶液的吸光度值，繪制絲氨酸濃度與吸光度值對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 溶液的制備a.0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.105 1 g L—絲氨酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于99%)溶解定容至50 mL.b.0.04 mol/L茚三酮溶液的配制：稱取茚三酮0.356 3 g于50 mL離心管中，加25 mL水和0.014 3 g氯化亞錫(SnCl2)，微微加熱使茚三酮溶解，放在暗處，靜置過(guò)夜，過(guò)濾后定容至50 mL.c.配制不同pH的緩沖溶液：醋酸—醋酸鈉緩沖液的pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5,磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉緩沖液的pH分別為6.0、7.0.

1.3.2 絲氨酸—茚三酮反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的光譜掃描 反應(yīng)體系：準(zhǔn)確量取0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，pH值為6.0的緩沖溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，再加入1.0 mL的0.04 mol/L茚三酮溶液，定容至10 mL.混勻，取出混合液2 mL于10 mL具塞離心管中，加塞于沸水浴中反應(yīng)一定時(shí)間，取出置冰水中迅速冷卻至室溫.將絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品與茚三酮反應(yīng)后的產(chǎn)物在UV-240紫外掃描儀上掃描，尋找400 nm與700 nm之間的最大吸收波長(zhǎng).

1.3.3 顯色反應(yīng)條件的選擇 為了研究絲氨酸與茚三酮反應(yīng)的最佳條件，可改變1.3.2的反應(yīng)體系中的單一因素，并以相應(yīng)的空白值做對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以確定反應(yīng)的最佳相對(duì)用量和時(shí)間.

1.3.4 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 確定最佳茚三酮用量、最佳反應(yīng)時(shí)間之后，控制絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用量呈梯度變化，參照1.3.2的反應(yīng)體系，測(cè)定吸光度，將吸光度對(duì)濃度進(jìn)行直線回歸，得絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程.

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度的檢測(cè) 取一定體積的已知濃度的溶液，分別加入pH值為4.5，5.0和6.0的緩沖溶液，按上述方法分別測(cè)定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上的數(shù)學(xué)表達(dá)式中計(jì)算出絲氨酸的質(zhì)量濃度，測(cè)三次取平均值.計(jì)算誤差值.

2 結(jié)果與分析

2.1 絲氨酸—茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)定波長(zhǎng)的測(cè)定

將絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后的產(chǎn)物在UV-240紫外掃描儀上掃描，絲氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物在570 nm處有最大吸收，故選擇570 nm為測(cè)定波長(zhǎng).

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 絲氨酸與茚三酮相對(duì)用量的選擇 取1.0 mL濃度為0.02 mol/L的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于一組10 mL的容量瓶，瓶中加入1.0 mL pH4.5的緩沖溶液，分別往瓶中加入0.6，0.8，1.0，1.2，1.5，1.6，1.8，2.0，2.2 mL 0.04 mol/L茚三酮溶液，參照1.3.2顯色測(cè)定各顯色體系的吸光度，結(jié)果如圖所示.

圖1 不同茚三酮用量對(duì)顯色體系吸光度的影響

由圖1可知，取0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用量為1.0 mL，茚三酮用量小于1.5 mL(摩爾比3∶1)時(shí)，隨著茚三酮用量的不斷增加，吸光度值不斷變大，當(dāng)茚三酮用量為1.5 mL(摩爾比3∶1)時(shí)，吸光度接近最大值，從保證實(shí)驗(yàn)效果和節(jié)約顯色劑用量的角度考慮，茚三酮與絲氨酸的摩爾比為3∶1時(shí)比較恰當(dāng).

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間和pH值的選擇 取0.2 mL濃度為0.02 mol/L的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于一組容量瓶，向瓶中加入0.3 mL 0.04 mol/L 的茚三酮溶液，參照1.3.2顯色，研究不同反應(yīng)時(shí)間和不同pH值條件下的吸光度，結(jié)果如圖2所示.

由圖2A可知，反應(yīng)時(shí)間30 min時(shí)有最大吸光度值.由圖2B可知，pH值對(duì)絲氨酸與茚三酮的顯色反應(yīng)有極大的影響，且不同pH值對(duì)其影響的規(guī)律并不明顯，這是因?yàn)樵诓煌膒H值條件下，反應(yīng)的機(jī)理并不相同，生成的有色物質(zhì)也不一樣[21-22].為了準(zhǔn)確測(cè)定絲氨酸的含量，必須根據(jù)體系pH值的需要，測(cè)定不同pH值條件的絲氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

A.不同反應(yīng)時(shí)間

B.不同pH值條件

2.3 幾種不同pH值條件下絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.3.1 pH值為4.5的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一組10 mL的容量瓶，按表1依次加入0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入pH為4.5的緩沖溶液1.0 和1.5 mL茚三酮.在100 ℃條件下，反應(yīng)30 min.按1.3.2方法測(cè)定吸光度.結(jié)果如表1所示.

表1 pH值為4.5時(shí)絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)據(jù)

以標(biāo)準(zhǔn)絲氨酸質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，以吸光度值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得其回歸方程為y=5.595x+0.056，相關(guān)系數(shù)R2= 0.991 2.

圖3 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(pH=4.5)

2.3.2 pH值為5.0時(shí)的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一組10 mL的容量瓶，按表2依次加入0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入pH為5.0的緩沖溶液1.0 mL和0.525 mL茚三酮，在100 ℃條件下，反應(yīng)30 min.按1.3.2方法測(cè)定吸光度.結(jié)果如表2所示.

表2 pH值為5.0時(shí)絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

以標(biāo)準(zhǔn)絲氨酸質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，以吸光度值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得其回歸方程為y=10.59x+0.023，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 5.

圖4 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(pH=5.0)

2.3.3 pH值為6.0時(shí)的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一組10 mL的容量瓶，按表2依次加入0.02 mol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入pH為6.0的緩沖溶1.0和0.21 mL茚三酮.在100 ℃條件下，反應(yīng)30 min.按1.3.2方法測(cè)定吸光度.結(jié)果如表3所示.

表3 pH值為6.0時(shí)絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

以標(biāo)準(zhǔn)絲氨酸質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)，以吸光度值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得其回歸方程為y=37.824x+0.003 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 5.

圖5 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(pH=6.0)

2.4 方法準(zhǔn)確度的檢測(cè)

配制濃度為0.01 mol/L的絲氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，分別用移液槍準(zhǔn)確量取體積為200 uL的溶液三份，放入標(biāo)號(hào)為1，2，3的三只10 mL的容量瓶中，據(jù)相對(duì)摩爾比為(3∶1)的比例，各加入0.02 mol/L的茚三酮溶液280 uL，然后依次加入500 uL，pH值分別為4.5，5.0和6.0的緩沖溶液，依1.3.2試驗(yàn)步驟，測(cè)定三只容量瓶里溶液反應(yīng)后的吸光度，結(jié)果如表4所示.

表4 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度的檢測(cè)

3 結(jié) 語(yǔ)

用酶標(biāo)儀分光光度法確定了絲氨酸與茚三酮顯色反應(yīng)的最佳時(shí)間為30 min和相對(duì)摩爾比為1∶3，反應(yīng)的溫度為100 ℃.據(jù)絲氨酸磷脂制備體系反應(yīng)后測(cè)定絲氨酸含量的需要，筆者還測(cè)定了pH值分別為4.5，5.0和6.0時(shí)的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.pH值為4.5時(shí)，y=5.595x+0.056 (R2=0.991 2)；pH值為5.0時(shí)，y=10.59x+0.023(R2=0.998 5)；pH值為6.0時(shí)，y=37.388x+0.005 2(R2=0.991 5)，用已知質(zhì)量濃度的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度進(jìn)行檢測(cè)，誤差范圍為-6.26%～+3.78%.應(yīng)用茚三酮—分光光度法測(cè)定由卵磷脂制備絲氨酸磷脂體系中的絲氨酸質(zhì)量濃度時(shí)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，節(jié)約成本，重復(fù)性好.

參考文獻(xiàn)：

[1]Scholl-burgi S, Heinz-erian P. Amino acid cerebrospinal fluid/plasma ratios in children: influence of age, gender, and antiepileptic medication[J]. Pediatrics, 2008(4): 920-926.

[2]Karakecili A G, Demirtas T T. Evaluation of L929 fibroblast attachment and proliferation on Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)-immobilized chitosan in serum-containing/serum-free cultures[J]. J Biosci Bioeng,2007(1): 69-77.

[3]Jones C M, Smith M. Reference data for cerebrospinal fluid and the utility of amino acid measurement for the diagnosis of inborn errors of metabolism[J]. Ann Clin Biochem, 2006, 43：63-66.

[4]Manso Filho H C, Mckeever K H, Gordon M E, et al. Developmental changes in the concentrations of glutamine and other amino acids in plasma and skeletal muscle of the Standardbred foal.[J]. Anim Sci, 2009(03)：23-29.

[5]Yin Z, Albrecht J, Syversen, et al. Comparison of alterations in amino acids content in cultured astrocytes or neurons exposed to methylmercury separately or in co-culture[J]. Neurochem Int, 2009, 55(1-3): 136-42.

[6]傅莉，劉信洪，徐春艷，等. HPLC法監(jiān)測(cè)DL-絲氨酸的合成研究[J]. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003(4)：105-108.

[7]Tsiao H Y, Wei T. Enzymatic prA570uction of L-Serine[J]. Biotech and Bioeng, 1996(28): 857-867.

[8]Kubota H. Fermentation of L-serine from Glycine byCorynebacterium glycinophilum. [J]. Gen. Appl. Microbiol, 1992(18): 365-37.

[9]Heptner G, Domschke. Amino acid level in plasma--expressed as alpha-amino-nitrogen reaction to stimulation of the exocrine pancreas: approaches to a new pancreatic function test. Klin Wochenschr，1987, 65: 1054-1061.

[10]王雅琴，李緒昆. 采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定黃酒中的游離氨基酸[J].食品與發(fā)酵工程，2005(4)：23-25.

[11]王薇，立周. 分光光讀法測(cè)定生物轉(zhuǎn)化體系中的L-絲氨酸[J]. 江蘇食品發(fā)酵，2008(1)：43-46.

[12]周圓圓，朱敏，王磊，等. 變色酸-分光光度法測(cè)定絲氨酸含量[J]. 氨基酸和生物資源，2007(1)：73-76.

[13]魏東，譚慧林，楊海燕. L-絲氨酸高產(chǎn)菌株的選育和搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 氨基酸和生物資源，2006，28(1): 46-48.

[14]高偉, 張偉國(guó). L-絲氨酸產(chǎn)生菌的選育與發(fā)酵條件的初步研究[J]. 發(fā)酵科技通訊，2007，36(2): 12-15.

[15]歐倩，韋東，武波. 絲氨酸生產(chǎn)菌的篩選及靜息細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中L-絲氨酸的合成[J]. 氨基酸和生物資源，2006，28(3): 41-44.

[16]陳忠云. α-氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)機(jī)理研究[J].化學(xué)與生物工程，2004(6)：1-3.

[17]錢和，郝剛. L-精氨酸高產(chǎn)菌的育選育[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2005，32(3): 46-50.

[18]盧發(fā)，張偉國(guó). 紙層析-分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中L-絲氨酸和甘氨酸的含量[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，31(3)：119-121.

[19]Zerweck J, Masch A, Schut kowski M, et al. Peptide microarrays for profiling of mA570ification state-specific antibA570ies[J]. MethA570s Mol Biol，2009, 24: 169-180.

[20]Stabler T V, Byers S S, Zura R D, et al. Amino acid racemization reveals differential protein turnover in osteoarthritic articular and meniscal cartilage[J]. S Arthritis Res Ther，2009(2): 34-37.

[21]陳忠云. α-氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)機(jī)理研究[J]. 化學(xué)與生物工程，2002(6)：11-13.

[22]張振華. α-氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)影響因素的探究[J]. 邵陽(yáng)師范學(xué)報(bào)，2003(1)：19-22.