宋翠淼， 楊秀芳， 杜惠蘭*， 馬惠榮， 段彥蒼， 曹 剛， 李國明， 陸 君

（1.河北醫(yī)科大學(xué)生理教研室;2.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合婦產(chǎn)科教研室，河北石家莊 050091）

無排卵是不孕癥、閉經(jīng)、功血、多囊卵巢綜合征等多種婦科疾病共同的病理現(xiàn)象，嚴(yán)重影響婦女的身心健康。關(guān)于無排卵的發(fā)生機(jī)制方面尚有許多不明之處。已有的研究認(rèn)為，白介素－6、腫瘤壞死因子－α、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子－α、myc癌基因蛋白、內(nèi)皮素－1、胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子等均可影響卵泡發(fā)育及黃體形成，從而參與調(diào)節(jié)卵巢功能［1－3］。有學(xué)者觀察卵泡發(fā)育障礙、無排卵及不育患者存在卵巢血液供應(yīng)障礙，且生殖器官血液供應(yīng)與卵泡發(fā)育和生殖內(nèi)分泌水平密切相關(guān)［4，5］。本實驗運(yùn)用雄激素致無排卵大鼠模型，研究補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對其血漿及卵巢血管舒張因子一氧化氮（Nitric oxide，NO）、環(huán)磷酸鳥苷（Cyclic guanosine monophosphate，cGMP）、神經(jīng)型一氧化氮合酶（Neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS），血管收縮因子內(nèi)皮素－1（Endothelin －1，ET－1）、血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，ATⅡ）的影響，以探討補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方治療無排卵性疾病的作用及機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 同批出生9日齡健康♀性SD大鼠40只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，清潔級，合格證號:鄂醫(yī)動字19－020。

1.1.2 藥物制備及試劑 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方由熟地、枸杞、覆盆子、淫羊藿、紫河車、當(dāng)歸、白芍、香附、紅花、川芎、桃仁等組成。一次性購自石家莊樂仁堂。丙酸睪丸酮注射液（批號:0203232），天津市氨基酸公司生產(chǎn);ET－1、ATⅡ、NO 放免試劑盒 （批號:20040423）均購自南京建成生物工程研究所;125I標(biāo)記cGMP放免試劑盒（批號:20040625）由上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室提供;E2（批號:S10950184）、P（批號:S10950183）、T（批號:S10940111）放免試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司;一抗:nNOS、eNOS（兔抗大鼠、小鼠等）工作液均購自武漢博士德生物工程有限公司;ET－1（兔抗大鼠、小鼠等）工作液購自北京中山生物技術(shù)有限公司。二抗、三抗:SP－9001、兔 SP kit，購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥制備 將當(dāng)歸、紅花、川芎、香附提取揮發(fā)油后，加8倍量水與補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方的其它藥物共同浸泡40 min，煮沸后文火煎煮60 min，濾出藥液;藥渣加2倍水量繼續(xù)煎煮40 min，合并兩次濾液，水浴濃縮，與揮發(fā)油混和均勻，放置于4℃冰箱中密閉保存。每1 mL藥液含生藥5.3 g，相當(dāng)于臨床用量的20倍。

1.2.2 動物分組及無排卵大鼠模型制備 參照俞瑾［6］等方法建立雄激素致無排卵大鼠模型。9日齡同批出生SD雌性大鼠40只，隨機(jī)分為正常對照組（簡稱“正常組”）、雄激素致無排卵大鼠模型組（簡稱“模型組”）和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方治療組（簡稱“中藥治療組”），正常組12只，其余兩組為14只。模型組及中藥治療組大鼠頸背部皮下一次性注射丙酸睪丸酮1.25mg，正常組注射同等量中性茶油。21日齡斷乳，25℃恒溫（50%濕度）清潔級飼養(yǎng)，不加飼維生素類制品。12 h光照（6:00～18:00）和12 h黑暗周期交替進(jìn)行。70日齡起連續(xù)兩個性周期（一個性周期4～5 d）做陰道脫落細(xì)胞涂片，陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化，提示雄激素致無排卵大鼠模型成功。81日齡起，模型組、中藥治療組（選擇陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化的大鼠各10只）分別灌服蒸餾水和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方，每100 g體重給藥1 mL，連續(xù)7周。正常組（選擇陰道上皮細(xì)胞呈規(guī)律的周期性變化的大鼠10只）同法灌服等量蒸餾水。

1.2.3 取材及指標(biāo)觀察 于給藥6周后每日上午做陰道脫落細(xì)胞涂片一次，連續(xù)1周，處死前2 d，每隔2 h涂片一次以確定動情周期，以0.5%的堿性美藍(lán)溶液染色10 min，自來水輕輕洗去多余的染色液，待干，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，確定動情周期。130、131日齡正常組及中藥治療組處于同一動情期的大鼠及模型組（無性周期）大鼠斷頭取血，制備血漿、血清，置于－70℃保存，用放射免疫分析法檢測血漿NO（利用硝酸還原酶特異性將NO－3還原為NO－2，通過顯色深淺測定其濃度的高低，用其代表血漿NO 水平）、cGMP（125I標(biāo)記）、ET－1（非平衡法）、ATⅡ（均相競爭法）以及血清E2、P和T含量。無菌操作剖腹取出同一側(cè)卵巢組織，4%多聚甲醛溶液中固定，分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色（在同一條件下按SP法進(jìn)行），以觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化和卵巢組織 nNOS、eNOS、ET－1的表達(dá)強(qiáng)度。基本步驟為:石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加一抗，4℃冰箱過夜。PBS沖洗，5 min×3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育10 min，PBS沖洗，5 min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育10 min，PBS沖洗，5 min×3次。DAB顯色5 min，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡檢。用已知的陽性切片同時在同一條件下染色作為陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 免疫組化圖像分析 正常組、模型組和中藥治療組分別隨機(jī)選取3只大鼠卵巢做免疫組織化學(xué)染色切片，每個卵巢隨機(jī)選取1張切片進(jìn)行分析，每張切片取顆粒細(xì)胞、髓質(zhì)兩區(qū)，每區(qū)取6個視野，用同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析nNOS、eNOS、ET－1在卵巢組織切片中表達(dá)的平均灰度，以指征陽性信號的表達(dá)強(qiáng)度。根據(jù)病理圖文分析系統(tǒng)設(shè)置，平均灰度值與陽性表達(dá)強(qiáng)弱呈反比。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清 E2、P、T含量 E2/P及血漿 NO、cGMP、ET－1、ATⅡ含量的比較

與正常組比較，模型組大鼠血清E2、T含量及E2/P顯著升高（P＜0.01）;血漿NO、cGMP含量降低（P＜0.01），血漿 ET－1、ATⅡ含量升高（P＜0.01）。與模型組比較，正常組、中藥治療組大鼠血清 E2、T、E2/P 顯著降低（P＜0.01）;血漿 NO、cGMP含量升高（P＜0.01），血漿 ET－1、ATⅡ含量降低（P＜0.01）。見表1。

表 1 三組大鼠血清 E2、P、T 含量 E2/P 及血漿 NO、cGMP、ET-1、ATⅡ含量的比較（n=10，±s）

表 1 三組大鼠血清 E2、P、T 含量 E2/P 及血漿 NO、cGMP、ET-1、ATⅡ含量的比較（n=10，±s）

與模型組比較，**P＜0.01;與正常組比較，☆P＜0.05，☆☆P ＜0.01。

分組 E2/（pg/mL） P/（ng/mL） E2/P T/（ng/dL） NO/（μmol/L）cGMP/（pm/mL）ET－1/（pg/mL） ATⅡ/（pg/mL）正常組 4.14±1.40** 5.42±1.61 0.76±0.32** 0.97±0.37** 55.00±8.94** 0.17±0.02** 49.94±6.61** 90.88±7.71**模型組 8.50±0.85☆☆ 5.19±1.03 1.74±0.48☆☆ 2.08±0.32☆☆ 21.00±5.73☆☆ 0.12±0.02** 61.56±4.17☆☆ 129.41±7.29☆☆中藥治療組 4.59±0.83** 5.52±2.16 0.87±0.29** 1.26±0.39**44.33±6.19**☆ 0.15±0.01** 49.33±5.55** 90.42±8.78**

2.2 大鼠卵巢組織nNOS、eNOS及ET－1表達(dá)的比較

與正常組比較，模型組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞nNOS、eNOS以及髓質(zhì)nNOS表達(dá)明顯減弱（P＜0.01），顆粒細(xì)胞以及髓質(zhì)ET－1表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）;與模型組比較，正常組、中藥治療組卵巢顆粒細(xì)胞nNOS、eNOS以及髓質(zhì)nNOS表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。顆粒細(xì)胞及髓質(zhì)ET－1表達(dá)明顯減弱（P＜0.01）。見表2，圖1～3。

表2 三組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞nNOS、eNOS、ET-1及髓質(zhì)nNOS、ET-1表達(dá)的平均灰度比較（±s）

表2 三組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞nNOS、eNOS、ET-1及髓質(zhì)nNOS、ET-1表達(dá)的平均灰度比較（±s）

與模型組比較，**P＜0.01;與正常組比較，☆☆P＜0.01。

分組 顆粒細(xì)胞髓質(zhì)nNOS eNOS ET－1 nNOS ET－1正常組 66.65±4.20** 48.56±4.17** 81.77±2.29** 104.66±3.75** 147.61±7.74**模型組 77.17±9.46☆☆ 65.19±5.80☆☆ 56.44±6.20☆☆ 132.02±7.82☆☆ 100.36±4.84☆☆中藥治療組 65.54±6.94** 48.53±2.57** 83.29±3.74** 111.95±5.97** 139.40±9.43**

圖1 nNOS在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)（×400）

圖2 eNOS在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)（×400）

圖3 ET-1在大鼠卵巢髓質(zhì)的表達(dá)（×400）

2.3 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

正常組大鼠卵巢可見各級發(fā)育良好卵泡及黃體。模型組大鼠卵巢多數(shù)卵泡呈囊性擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞層次明顯減少，腔內(nèi)無卵丘及卵細(xì)胞，沒有黃體形成。中藥治療組大鼠卵巢的結(jié)構(gòu)有一定改善，卵泡發(fā)育。見圖4。

圖4 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化（HE，×100）

3 討論

無排卵多表現(xiàn)為卵泡在排卵前的閉鎖。Flerko等［7］認(rèn)為卵泡膜毛細(xì)血管血流量的減少在導(dǎo)致大多數(shù)卵泡于竇前期閉鎖中發(fā)揮重要作用。有研究證實，與正常婦女相比，不孕癥患者卵巢動脈舒張期血流呈高阻抗、無成熟卵泡且卵巢甾體激素變化無規(guī)律，提示卵泡發(fā)育障礙、無排卵及不育患者存在卵巢血液供應(yīng)障礙，且生殖器官血液供應(yīng)與卵泡發(fā)育和生殖內(nèi)分泌水平密切相關(guān)［4－5］。其相關(guān)性表現(xiàn)在卵泡的血管生成調(diào)控卵泡的生長發(fā)育和閉鎖，體內(nèi)對促性腺激素的選擇性攝取與優(yōu)勢卵泡的血液供應(yīng)增加一致［8］。

Klipper等［9］發(fā)現(xiàn)大鼠卵巢靜脈血中 ET－1 含量顯著高于動脈血，提示卵巢自身能分泌ET，而ET是迄今所知具有最強(qiáng)縮血管作用的活性多肽。已有研究證實NO可引起血管舒張，從而調(diào)節(jié)卵巢功能，其作用機(jī)制是通過NO－cGMP（環(huán)磷酸鳥苷）通路實現(xiàn)的［10］。NOS是NO合成的起始酶和限速酶。NOS可分為原生型NOS（cNOS）和誘生型NOS（iNOS）兩大類，原生型NOS又分為內(nèi)皮型NOS（eNOS）和神經(jīng)型NOS（nNOS）。生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮可通過cNOS不斷釋放低水平的NO。NO與鳥苷酸環(huán)化酶中亞鐵血紅蛋白部分結(jié)合，激活該酶而使cGMP增高，引起血管平滑肌舒張。

本實驗結(jié)果表明:與模型組比較，中藥治療組大鼠血漿ET－1、ATⅡ含量明顯降低，卵巢顆粒細(xì)胞、髓質(zhì) ET－1表達(dá)亦明顯降低。ET－1、ATⅡ具有明顯的縮血管作用。與模型組比較，中藥治療組大鼠血漿NO、cGMP含量明顯升高，卵巢顆粒細(xì)胞 nNOS、eNOS、髓質(zhì)nNOS表達(dá)明顯增強(qiáng)，可能導(dǎo)致舒張血管的生理性效應(yīng)產(chǎn)物 －NO、cGMP生成增多。NO、cGMP具有明顯的舒血管作用。中藥治療組大鼠血漿、卵巢血管舒－縮因子的變化，可能改善了卵巢的血液供應(yīng)，阻礙了大多數(shù)卵泡于竇前期閉鎖，并促進(jìn)優(yōu)勢卵泡對促性腺激素的選擇性攝取，有利于卵泡的正常發(fā)育，卵子排放及黃體形成。

無排卵多表現(xiàn)為卵泡在排卵前的閉鎖，而卵泡閉鎖與卵泡細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的凋亡有關(guān)［11］。有報道NO對于體外培養(yǎng)卵泡的正常發(fā)育是必須的，卵泡發(fā)育受阻和排卵抑制都與抑制NO合成相關(guān)。小卵泡的顆粒細(xì)胞中高水平的NO會抑制細(xì)胞的凋亡，而大卵泡的顆粒細(xì)胞中低水平的NO有相反的效應(yīng)［12］。

本實驗結(jié)果表明:與模型組比較，中藥治療組大鼠血漿NO含量明顯升高，卵巢顆粒細(xì)胞 nNOS、eNOS表達(dá)明顯增強(qiáng)，可能導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞NO水平升高，抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，阻礙卵泡在排卵前閉鎖，促使卵泡發(fā)育。

另外，本實驗結(jié)果顯示:無排卵大鼠模型表現(xiàn)為血清E2、T水平升高以及E2/P值的異常升高。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可能通過降低無排卵大鼠模型血清E2水平，解除異常增高的E2對下丘腦分泌促性腺激素釋放激素及垂體分泌促性腺激素的抑制作用，使各級卵泡進(jìn)一步發(fā)育，成熟卵泡不斷形成，排卵功能進(jìn)一步恢復(fù)。也可能通過降低無排卵大鼠模型異常增高血清T水平，間接促進(jìn)卵泡發(fā)育。因為生理劑量的雄激素是女性維持正常生殖所不可缺少的，高雄激素可引起黃體生成素/卵泡刺激素比例失調(diào)，對卵泡發(fā)育不利，即使部分排卵，常發(fā)生黃體功能不全［13］。

形態(tài)學(xué)顯示:正常大鼠卵巢各級卵泡發(fā)育良好以及黃體形成，而無排卵大鼠模型卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡多數(shù)呈囊性擴(kuò)張，顆粒細(xì)胞層明顯減少，沒有黃體的形成。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能使無排卵大鼠模型卵巢顆粒層明顯增厚，可見發(fā)育期的卵泡，并見黃體形成，一定程度地改善無排卵大鼠模型卵巢的結(jié)構(gòu)。

補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方由養(yǎng)精種玉湯合五子衍宗丸加減化裁而成。方中熟地滋補(bǔ)肝腎，填精養(yǎng)血而為君藥。枸杞子、山萸肉、紫河車助君藥滋腎益精，補(bǔ)養(yǎng)沖任;覆盆子、淫羊藿、山藥溫腎益氣，“陽中求陰”;當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，共為臣藥。佐香附、紅花理氣活血，調(diào)暢沖任，進(jìn)而改善卵巢局部血液供應(yīng)。諸藥合用，滋腎陰、溫腎陽、填精血、調(diào)沖任，以達(dá)補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)之功，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)卵巢功能的作用。

綜上認(rèn)為，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方使無排卵大鼠模型血漿、卵巢組織中血管舒張因子的含量以及表達(dá)增加，血管收縮因子的含量以及表達(dá)減少，一方面可能改善了卵巢的血液供應(yīng)，另一方面可能阻礙了顆粒細(xì)胞的凋亡。以上兩方面均可抑制卵泡在排卵前閉鎖，促進(jìn)卵泡的發(fā)育，排卵。另外，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方通過降低無排卵大鼠模型血清高水平E2、T，對卵泡的發(fā)育可能發(fā)揮了一定的作用。

［1］Wu R，F(xiàn)ujii S，Ryan N K，et al.Ovarian leukocyte distribution and cytokine/chemokine mRNA expression in follicular fluid cells in women with polycystic ovary syndrome ［J］.Hum Reprod，2007，22（2）:527－535.

［2］張利軍，王根林.IGFs和EGF對卵泡發(fā)育的調(diào)控［J］.生殖與避孕，2004，24（2）:108－110.

［3］Toshiro K.Role of vasoactive substances on endometrial and ovarian function［J］.Reprod Med Bio，2007，6（3）:157－164.

［4］周 莉，亓 蓉，梁 瑩，等.經(jīng)陰道彩色多普勒觀察卵巢血流灌注與卵泡發(fā)育的關(guān)系［J］.生殖與避孕，2008，28（7）:441－443.

［5］蘇繼蓮，羅 潔，應(yīng)偉雯.不孕婦女卵巢血供彩色多普勒特點與卵巢功能的相關(guān)性研究［J］.實用婦產(chǎn)科雜志，2008，24（4）:223－225.

［6］俞 瑾，楊淑萍，張月萍，等.雄激素致高胰島素高雄激素性無排卵大鼠模型［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，1993，2（4）:251－259.

［7］Flerko B，Setalo G，Tima L.Reproduction and development:Advances in physiological sciences Vol.15 pergamon press and Akademia Kiado press［C］.Budapest，1980:79－89.

［8］王桂敏，鄭淑蓉.女性生殖器官血管研究現(xiàn)狀［J］.生殖與避孕，1996，16（1）:3－6.

［9］Klipper E，Gilboa T，Levy N，et al.Characterization of endothelin－1 and nitric oxide generating systems in corpus luteum－derived endothelial cells［J］.Reproduction，2004 ，128（4）:463－473.

［10］Nelson S H，Steinsland O S，Wang Y，et al.Increased nitric oxide synthase activity and expression in the human uterine artery during pregnancy［J］.Circ Res，2000，87（5）:406－411.

［11］徐富翠，郭 勇，梅欣明.卵泡發(fā)育與其細(xì)胞凋亡［J］.四川解剖學(xué)雜志，2002，10（2）:99－104.

［12］吳向豐，桑潤滋，張增力，等.一氧化氮對下丘腦－垂體－卵巢軸的生理調(diào)控［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26（7）:4－7.

［13］魏兆蓮，李美芝，陳詠健.高雄激素血癥對子宮內(nèi)膜功能的影響［J］.中國婦產(chǎn)科臨床，2002，3（3）:145－147.