鐘嘉明，張佳林，李曉航，張成鈞，程穎，劉永鋒

（中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院普通外科教研室，肝膽外科暨器官移植科，沈陽 110001）

胰島移植是治療1型糖尿病的一種理想方法。但目前臨床療效尚不理想，主要原因在于缺乏足夠數(shù)量的胰島、胰島移植后排斥反應及胰島移植后早期功能丟失等問題尚未解決［1］。因此，如何獲得足量、純凈且有良好活性的胰島非常重要。盡管胰島細胞分離與純化技術正在不斷改善，但獲得的胰島細胞在收獲量、活性及純度上仍然不盡人意［2］。由于影響胰島分離效果的因素較多，胰島的收獲量與純度難以同時達到標準。目前小鼠胰島分離方法主要采用經(jīng)膽道胰管逆行灌注膠原酶充分消化胰腺后，通過梯度離心法來分離純化胰島。本研究主要從膠原酶濃度和消化時間方面來探討如何提高小鼠胰島細胞分離純化后的產量和質量。

1 材料與方法

1.1 材料

8~12周BALB/c雄性小鼠，購自中國醫(yī)科大學和中科院動物實驗中心。Hanks液自行配制；Eurocollins-Ficoll液、雙硫腙（dithizon，DTZ）、吖啶橙（acridine orange，AO）和碘化丙錠（propidium iodide，PI），均購于美國Sigma公司；膠原酶P和HEPES，購于德國Boehringer Mannheim公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清，購于Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 胰島分離：Balb/c小鼠共15只，非禁食，用乙醚吸入性麻醉后四肢固定，噴灑75%乙醇消毒胸腹部，腹部楔形切開，暴露腹腔，沿十二指腸找到膽總管。近十二指腸處結扎膽總管，“破心”處死小鼠，用27G靜脈注射針經(jīng)膽總管分別逆行灌注濃度為0.5、1.0和1.5 mg/ml膠原酶P溶液3~4 ml。當胰腺膨脹后迅速剪取胰腺，置入含3ml膠原酶P溶液（1 mg/ml）的離心管（50 ml）中，于37℃恒溫水浴箱中邊振蕩邊消化，分別消化20、25和30min，然后加入4℃含5%胎牛血清和10mmol/LHEPES的Hanks液稀釋并終止消化，4℃條件下800rpm離心2min，洗3遍。

1.2.2 胰島純化：將上述分離的胰島沉淀物加入3 ml密度為1.110的Eurocollins-Ficoll液，充分混勻，隨后依次緩慢加入密度為 1.096（3 ml）、1.074（2 ml）和1.069（2 ml）的Eurocollins-Ficoll液，最后加入Hanks液2 ml，4℃條件下2 000 rpm離心20 min，吸取1.069~1.074及1.074~1.096界面上的細胞團，Hanks液洗3遍。純化的胰島細胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 胰島形態(tài)觀察及計數(shù)：采用DTZ染色法觀察計數(shù)，DTZ為螯合指示劑，可與含鋅的胰島B細胞螫合而使胰島呈猩紅色［3］，其他外分泌腺細胞不著色。用100μl加樣器在胰島懸液中重復取樣3次，分別置于24孔板內，加入少量DTZ染液，混合后室溫下孵育l0 min，鏡檢計數(shù)DTZ陽性細胞團數(shù)，按以下公式計數(shù)胰島：胰島數(shù)=3次陽性總數(shù)÷3×10×樣本量（m1），將1個直徑為150μm的胰島團塊稱為1個胰島當量（islet equivalent，IEQ）。

1.2.4 胰島細胞活性測定：采用AO/PI熒光染色法判定胰島細胞活性。AO/PI溶液配制：用Hanks液配制儲存液 AO 為 670μmol/L，PI為 750μmol/L，4℃避光保存。用前取0.01 ml AO與l ml PI混合，用Hanks液稀釋10倍，與胰島制備物混合10 min，在熒光顯微鏡下用490 nm激發(fā)光濾光片、510 nm光柵濾光片可同時見到綠色（AO）和紅色（PI）熒光，綠色標記的為活細胞，紅色標記的為死細胞。胰島細胞成活率用胰島活細胞占所有胰島活細胞和死細胞總數(shù)的百分比表示，每份標本重復計算4次，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均為計量資料，用x±s表示。用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膠原酶濃度及消化時間對胰島分離產量的影響

分離純化后的胰島細胞被DTZ染成猩紅色，鏡下表現(xiàn)為大小不一的圓形或卵圓形細胞團和散在細胞（圖1）。膠原酶濃度和消化時間對胰島產量有重要影響，在膠原酶有效發(fā)揮活性的條件下（37℃、pH7.8、［Ca2+］7.5 mmol/L）［4］，當膠原酶 P 濃度為 1.0 mg/ml、消化時間為25 min時胰島產量最高，與其他酶濃度和消化時間相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。見表1。

表1 不同消化條件分離純化單個胰腺獲得的胰島數(shù)量（x±s）Tab.1 Islet yield of one pancreas under different digestive conditions（x ±s）

2.2 膠原酶濃度及消化時間對胰島分離純度和活性的影響

分離純化的胰島被AO/PI染成綠色或紅色（圖2）。當膠原酶P濃度為1.0 mg/ml、消化時間為25 min時，純化后的胰島純度和活性均較其他消化條件高，但沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表2。

3 討論

表2 不同消化條件分離純化胰島的純度和成活率（x±s）Tab.2 Islet purity and viability after different digestive conditions（x ±s）

胰島移植物的數(shù)量和純度是決定移植成功與否的關鍵因素［5］。胰腺由內分泌部分胰島和外分泌部分胰腺腺泡組成，胰島散在于胰腺的腺泡實質中，其總體積僅占整個胰腺的1%～2%，因此胰島分離需將其從豐富的外分泌腺泡中分離開來。消化是胰島分離過程中最重要的一步，通過膠原酶消化可以使胰腺內分泌腺和外分泌腺完全分開；當胰島被完全消化下來時再進行純化，才可有效保證胰島的產量和質量，從而獲得較純的、有活性和功能的胰島細胞。

本研究通過采用不同濃度膠原酶灌注和不同消化時間，探討如何提高小鼠胰島分離純化后的產量、純度和活性。有研究表明，經(jīng)膽總管灌注膠原酶后進行胰腺消化，分離純化后的胰島細胞在產量、純度和活性方面均明顯高于其他灌注方法（如經(jīng)膽囊灌注、間質內注射或不灌注）［6~8］。因此，本研究采用經(jīng)膽總管灌注膠原酶消化方法進行胰島分離。經(jīng)膽總管灌注膠原酶后，一方面，通過機械擴張破壞胰腺外分泌腺泡，能更好地消化外分泌腺組織；另一方面，膠原酶在胰腺內外同時、同質消化，可減輕對胰島的損傷，也為有效地純化胰島創(chuàng)造了條件，保證胰島的產量和質量［6，9］。然而，由于小鼠胰膽管細而薄，插管難度較大，無法保證均可成功插管，尤其是初學者插管技術尚未熟練時更易失敗。因此，成功插管進行膽總管灌注是提高胰島產量和質量的前提，可以借助解剖鏡進行插管來提高成功率。為有效提高插管成功率，應充分暴露膽總管，通過膽總管下端結扎可使膽總管膨脹而變得明顯，充分游離膽總管后進行插管，有效固定針頭再進行灌注，一般每個胰腺可灌注3~4 ml膠原酶。

胰腺消化是胰島分離的關鍵步驟，許多因素可以影響胰島產量和質量，其中最重要的是膠原酶濃度和活性以及消化時間。目前最常用的是膠原酶V和膠原酶P，常用膠原酶濃度介于0.3~2.0 mg/ml。消化時間的把握對胰島產量和質量至關重要，如果消化時間過短，胰島將不能從胰腺組織中完全分離，其密度發(fā)生改變，使后續(xù)的純化過程中丟失大量胰島；反之，如果消化時間過長，容易破壞胰島，并產生膠狀物網(wǎng)羅大量胰島細胞團，也影響胰島產量和質量［10］。本研究探討了不同膠原酶濃度和消化時間對胰島分離純化的影響。為使膠原酶在最適條件下發(fā)揮高效的活性，我們設定消化溫度為37℃、膠原酶溶液 pH 7.8、［Ca2+］7.5 mmol/L，并用 10 mmol/L HEPES保持pH相對穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，在較高酶濃度下（1.5 mg/ml），雖然胰島能更徹底地從腺泡組織中釋放出來，但消化時間不好把握，如果時間過長，不利于胰島的純化并減少產量；在較低酶濃度下（0.5 mg/ml），胰島不易從腺泡組織中脫落，須延長消化時間；在1.0 mg/ml的酶濃度下，消化時間相對比較好把握，振蕩消化25 min能獲得最高的胰島產量。需要注意的是，在消化過程中振蕩動作應輕柔，避免過度用力，否則也容易產生膠狀物并降低胰島產量和質量。另外，不同類型、不同批號的膠原酶其酶活性是不一樣的［11］，即使是同一批酶，新鮮配置的酶溶液活性要強于配置后儲存的酶溶液。因此，在不同情況下，小鼠胰島分離條件的具體方案可能需做適當調整以期達到最佳效果。

總之，影響胰島細胞分離純化的因素較多，包括膠原酶灌注方法的差異、不同消化酶的應用、消化條件的不同程度地掌握以及操作人員熟練度等，這些因素始終貫穿著整個胰島細胞分離純化的過程，要提高胰島分離效果，關鍵在于對細節(jié)的把握和處理。本研究比較了不同膠原酶濃度和不同消化時間對小鼠胰島分離純化后產量和質量的影響，為小鼠胰島分離純化提供了實驗依據(jù)。

［1］Cattan P，Berney T，Schena S，et al.Early assessment of apoptosis in isolated isletsof Langerhans［J］.Transplantation，2001，71（7）：857-862.

［2］蔣鐵建，胡敏.嚙齒類動物胰島的分離與純化［J］.國外醫(yī)學內分泌學分冊，2001，21（1）：36-38.

［3］Latif ZA，Noel J，Alejandro R.A simple method of staining fresh and cultured islets［J］.Transplantation，1988，45（4）：827-830.

［4］Amoli MM，Moosavizadeh R，Larijani B.Optimizingconditionsfor rat pancreatic isletsisolation［J］.Cytotechnology，2005，48（1-3）：75-78.

［5］Nano R，Clissi B，Melzi R，et al.Islet isolation for allotransplantation：variablesassociated with successful islet yield and graft function［J］.Diabetologia，2005，48（5）：906-912.

［6］Andrades P，Asiedu C，Ray P，et al.Islet yield after different methods of pancreatic liberasedelivery［J］.Transplant Proc，2007，39（1）：183-184.

［7］Lakey JR，Warnock GL，Shapiro AM，et al.Intraductal collagenase delivery into the human pancreas using syringe loading or controlled perfusion［J］.Cell Transplant，1999，8（3）：285-292.

［8］陳創(chuàng)奇，詹文華，汪建平，等.多種分離純化大鼠胰島細胞的實驗方法比較［J］.中山醫(yī)科大學學報，2002，23（2）：118-120.

［9］周茂華，陳東明，唐軍民，等.大鼠胰島移植物制備與異種移植［J］.中華器官移植雜志，1998，19（4）：200-201.

［10］要秀，保庭毅.大鼠胰島分離與純化的實驗研究［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2001，22（4）：383-384.

［11］Saudek F，Cíhalová E，Karasová L.Islet yield and early function in rat-to-mousetransplantation usingdifferent typesof collagenase［J］.Transplant Proc，1997，29（4）：1963-1964.