浦踐一，魏曉璇，沈 揚(yáng)

(華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

TRAIL是腫瘤壞死因子(TNF)家族中的重要一員，其生物學(xué)特點(diǎn)是僅誘導(dǎo)多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常組織細(xì)胞沒(méi)有影響。目前已發(fā)現(xiàn)5種TRAIL受體，分別是死亡受體DR4、DR5，誘捕受體DcR1、DcR2和可溶性受體Oseoprotegerin(OPG)。DR4和DR5均含有“死亡結(jié)構(gòu)域”，可通過(guò)死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生;而DcR1和DcR2均缺乏細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，不能將凋亡信號(hào)向下傳遞，但均能競(jìng)爭(zhēng)性與TRAIL結(jié)合，干擾凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)。2008年12月～2009年12月，我們觀察了TRAIL對(duì)RPMI8226和U266的形態(tài)及其TRAIL受體表達(dá)水平的影響，探討TRAIL對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤的作用機(jī)制及細(xì)胞對(duì)其的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Triol、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及總RNA提純?cè)噭┖?北京賽百盛);瓊脂糖及綠色體系(Promega，USA);人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226及U266，用含20%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境孵育。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TRAIL干預(yù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI8226細(xì)胞及U266細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，分別加入終濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/ml的 TRAIL，作用24 h 后收集細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察不同濃度的TRAIL作用后RPMI8226及U266細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 TRAIL受體mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集TRAIL作用后的RPMI8226細(xì)胞及U266細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞總RNA，電泳鑒定RNA并定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用半定量RT-PCR法。取上述8 μl產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳50 min，在讀膠儀(AlphaImager1200)上進(jìn)行掃描，相應(yīng)位置上顯示有條帶者，為有目的基因的表達(dá)。各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平以其各自的灰度值除以相同標(biāo)本β-actin mRNA的灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。對(duì)資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。采用ANOVA方差分析，方差齊組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，方差不齊組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 倒置相差顯微鏡觀察RPMI8226細(xì)胞半貼壁生長(zhǎng)、U266細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，致密細(xì)胞團(tuán)樣，胞膜完整無(wú)破損，胞質(zhì)透明無(wú)顆粒。經(jīng)TRAIL 5 μg/ml處理后24 h可以見(jiàn)到典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為部分細(xì)胞懸浮，折光性減低，細(xì)胞體積變小、變形。隨著藥物濃度的增加及藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞明顯增加，出現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液混濁，折光性進(jìn)一步減低，并且出現(xiàn)細(xì)胞裂解碎片。而U266細(xì)胞的形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化。

2.2 TRAIL受體mRNA水平表達(dá) DR5 mRNA僅表達(dá)于RPMI8226細(xì)胞中(見(jiàn)圖1)，DcR1 mRNA僅表達(dá)于U266細(xì)胞中(見(jiàn)圖2)。而DR4和DcR2在RPMI8226與U266細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)。

圖1 不同質(zhì)量濃度TRAIL作用24 h DR5 mRNA水平表達(dá)變化

圖2 不同質(zhì)量濃度TRAIL作用24 h DcR1 mRNA水平表達(dá)變化

3 討論

TRAIL受體與TNFR1和Fas具有較高的同源性，而死亡受體和誘騙受體的序列之間亦具有相當(dāng)?shù)囊恢滦?。DR4和DR5廣泛分布于多種正常組織，在活化T細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá);含有與TNFR1和Fas相似的胞內(nèi)段“死亡結(jié)構(gòu)域”(DD)，具有凋亡誘導(dǎo)活性;而誘騙受體主要分布于正常組織，其中DcR1無(wú)胞內(nèi)段，無(wú)信號(hào)傳導(dǎo)功能，不能將凋亡信號(hào)下傳，DcR2的胞內(nèi)段僅含截?cái)嗟摹八劳鼋Y(jié)構(gòu)域”，DcR1、DcR2與 DR4、DR5競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TRAIL，干擾凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用。DcR2還可通過(guò)核因子-κB(NF-κB)抑制細(xì)胞凋亡［1］。OPG是一種分泌型糖蛋白，與 DcR1和DcR2一樣具有抑制凋亡的作用，可干擾表達(dá)ODF的成骨細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞與表達(dá)ODF受體的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞分化成熟，使骨密度增加［2］。

TRAIL與受體結(jié)合后促進(jìn)其形成三聚體，從而進(jìn)一步激活下游的多種效應(yīng)分子。TRAIL受體通過(guò)DD區(qū)與結(jié)合器蛋白Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)的DD結(jié)合，而使其募集至受體部位，F(xiàn)ADD又通過(guò)其氨基端死亡效應(yīng)區(qū)(DED)與Caspase-8的DED結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物(DISC)，使Caspase-8得以活化并發(fā)生自身磷酸化，從而進(jìn)一步啟動(dòng)下游Caspase蛋白酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后活化執(zhí)行激酶Caspase-3和剪切Bid。后者促使線粒體膜滲透性通透孔開(kāi)放，實(shí)現(xiàn)跨膜電位丟失，細(xì)胞色素C(CytC)外溢至胞質(zhì)，迅速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［3］。TRAIL凋亡途徑在胸腺細(xì)胞發(fā)育、病毒感染細(xì)胞和自身反應(yīng)T細(xì)胞的清除及NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫應(yīng)答細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷等方面具有重要意義［4，5］。除了通過(guò) Caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，TRAIL受體還可通過(guò)FADD/Caspase-8激活其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致癌基因c-fos、NF-κB 和 JNK 活化［6］。

本研究證實(shí)，TRAIL可誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡，而無(wú)法誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。通過(guò)對(duì)RPMI8226和U266細(xì)胞中表達(dá)的TRAIL相關(guān)受體(DR4、DR5、DcR1、DcR2)的測(cè)定，證明 TRAIL受體DR5在 RPMI8226中的表達(dá)水平高于 U266中的表達(dá);而TRAIL受體DcR1在U266中的表達(dá)水平高于RPMI8226中的表達(dá)，TRAIL受體DR4和DcR1在RPMI8226與U266中均無(wú)表達(dá)。提示TRAIL對(duì)MM細(xì)胞有選擇性毒性作用，TRAIL與其受體DR5結(jié)合后激活Caspase途徑誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞凋亡;而 DcR1受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TRAIL，干擾凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用，從而使U266細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥。

［1］Degli-Esposti MA，Dougall WC，Smolak PJ，et al.The novel receptor TRAIL-R4 induces NF-κB and protect incomplete death domain［J］.Immunity，1997，7(6):813-820.

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