吳 穹，郭志堅，馬祁生*

(1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，西寧810001;2青海交通醫(yī)院)

機(jī)體對低氧應(yīng)激反應(yīng)異常是導(dǎo)致各種高原適應(yīng)不全和急性高原病的重要原因。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的最重要的腦區(qū)之一。研究表明，應(yīng)激反應(yīng)可抑制海馬齒狀回顆粒細(xì)胞增殖，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞丟失、樹突萎縮等［1］。為探討高原低氧應(yīng)激對海馬神經(jīng)元凋亡的影響及機(jī)制，2007年8月～2009年10月我們進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 Leica EM UC6rt型超薄切片機(jī)，日立H-7500透射電鏡，F(xiàn)ACS420型流式細(xì)胞儀，LD4-2A離心機(jī);溴化乙啶(EB)染液(含EB 2 ml，RAN酶2 mg，枸櫞酸鈉200 ml，生理鹽水130 ml，雙蒸水70 ml，Triton-X100 2 ml)、RNA 酶、Triton-X100 均購于Sigma公司，羊抗大鼠COX-2多克隆抗體由Santa Cruz公司生產(chǎn)，SOD、MDA測試盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒、免疫組織化學(xué)試劑盒及顯色劑DAB均購于北京中山公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及模型建立 健康雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量(280±20)g，隨機(jī)分為低海拔組和高海拔組各24只。低海拔組于海拔400 m(陜西西安)處飼養(yǎng)，高海拔組從陜西西安運(yùn)至海拔4 300 m的青海果洛花石峽縣飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間均籠裝喂養(yǎng)，隨意進(jìn)食和飲水，光照時間8∶00～17∶00。兩組均飼養(yǎng)30 d。

1.2.2 相關(guān)指標(biāo)測定 ①海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài):兩組各取6只快速斷頭取腦，冠狀切取位于視交叉后1～4 mm處的腦組織，于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，石蠟包埋、切片(5 μm厚)，組織切片行硫堇染色，光學(xué)顯微鏡下觀片。將海馬從剩余腦組織剝離，切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊。于4%戊二醛固定4 h，PBS緩沖液清洗，1%鋨酸二次固定1.5 h，梯度丙酮脫水，Epon812環(huán)氧樹脂浸泡、包埋、聚合，超薄切片機(jī)切片，片厚50～70 nm，電鏡觀察。②海馬神經(jīng)元凋亡率:兩組各取6只快速斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬，用4℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗紅細(xì)胞后置于4℃預(yù)冷的70%乙醇中固定，4℃保存待用。將固定好的海馬組織剪碎，在120目不銹鋼網(wǎng)上用眼科鑷子輕輕揉搓，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完。將收集的混懸液用300目尼龍網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，500～800 r/min離心2 min。取單細(xì)胞懸液0.1 ml(含1×105個細(xì)胞)，加入 EB染液1 ml，4℃避光條件下進(jìn)行DNA染色30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行單參數(shù)檢測，檢測前以雞紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器的變異系數(shù)(CV)在5%以內(nèi)，測量數(shù)據(jù)輸入 HP-Consort30計算機(jī)，應(yīng)用 Single histogram statistics軟件進(jìn)行處理并打印出結(jié)果。由于凋亡細(xì)胞DNA發(fā)生有序降解，被降解的相對低分子質(zhì)量DNA片段從變性細(xì)胞膜漏出細(xì)胞外，使得凋亡細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減低，在流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA含量直方圖中G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。測凋亡峰的百分率及凋亡率。③海馬組織丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性測定:兩組各取6只，斷頭取腦組織于冰盤上分離出海馬，用冰生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙試干，稱重，放入10 ml的小燒杯內(nèi)。用帶刻度的滴管取預(yù)冷的生理鹽水(總量為組織塊重量的9倍)。用普通移液管移取少量于小燒杯中，用眼科小剪子盡快剪碎組織塊。將剪碎的組織和冷生理鹽水一起倒入勻漿管中，研磨制成10%的組織勻漿(操作過程中，小燒杯及勻漿管下端均處于冰水浴中)。將勻漿用低溫離心機(jī)在4℃條件下3 500 r/min離心15 min。取適量上清液，采用硫代巴比妥酸法測定CA1區(qū)MDA水平、黃嘌呤氧化酶法測定SOD性;用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。以上測定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。④環(huán)氧合酶(COX)-2表達(dá):兩組各取6只快速斷頭取腦，腦組織取材、固定、包埋、切片同硫堇染色。每例隨機(jī)選取CA1區(qū)5張切片，免疫組化法于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行定性觀察，計數(shù)COX-2陽性細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)均以±s表示。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 海馬CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu) 硫堇染色顯示低海拔組海馬CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰，錐體細(xì)胞分布均勻、排列整齊，4層以上，核大而圓，無異常;高海拔組海馬CA1區(qū)組織形態(tài)與對照組基本一致，但出現(xiàn)個別錐體細(xì)胞水腫及細(xì)胞間隙增寬的現(xiàn)象。電鏡觀察示低海拔組CA1區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核圓或橢圓，無增大，細(xì)胞器豐富。高海拔組CA1區(qū)錐體細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)豐富，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，核增大，核仁清楚，線粒體腫脹，數(shù)量減少。

2.2 海馬神經(jīng)元凋亡率、海馬組織MDA含量、SOD水平及COX-2的表達(dá) 見表1。

表1 兩組海馬神經(jīng)元凋亡率、海馬組織MDA水平、SOD 活性及 COX-2 表達(dá)(n=24，±s)

表1 兩組海馬神經(jīng)元凋亡率、海馬組織MDA水平、SOD 活性及 COX-2 表達(dá)(n=24，±s)

注:與低海撥組比較，*P＜0.05

組別 神經(jīng)元凋亡率(%)MDA水平(μmol/g)SOD活性(103U/g)COX-2陽性細(xì)胞(個/mm2)高海拔組 5.86±0.42* 6.845±0.236* 82.525±4.307 20.13±3.22*低海拔組 2.54±0.58 3.904±0.198 83.697±4.320 12.10±2.12

3 討論

高原低氧對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是一個極為復(fù)雜的過程，可通過多種機(jī)制影響機(jī)體學(xué)習(xí)記憶等高級功能。海馬與學(xué)習(xí)、記憶、行為、情緒密切相關(guān) ，也是應(yīng)激損傷的主要靶器官。研究發(fā)現(xiàn)，高原低氧會導(dǎo)致大鼠海馬部分神經(jīng)細(xì)胞血—腦屏障足突腫脹，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，提示有凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)，高原低氧降低大鼠學(xué)習(xí)記憶能力不僅具有時間依賴性，而且呈高度依賴形式［2］。

本研究硫堇染色顯示兩組CA1區(qū)組織形態(tài)基本一致，但出現(xiàn)個別錐體細(xì)胞水腫及細(xì)胞間隙增寬現(xiàn)象，說明高原并未對大鼠海馬神經(jīng)元造成顯著損傷。但通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，高海拔組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)增多，胞質(zhì)形成空泡;細(xì)胞核增大，線粒體膨脹，數(shù)量減少。線粒體是細(xì)胞的能量代謝中心，又是氧自由基產(chǎn)生的主要部位，線粒體被認(rèn)為在細(xì)胞缺氧中具有重要作用，本研究高海拔組海馬神經(jīng)元凋亡率明顯高于低海拔組，提示高原低氧應(yīng)激誘導(dǎo)了海馬神經(jīng)元凋亡。

目前認(rèn)為，在卒中、腦損傷以及各種神經(jīng)變性性疾病中，氧化應(yīng)激反應(yīng)是神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制。上述疾病病理生理變化中一個共同的特征是興奮性毒性引起的氧化應(yīng)激。細(xì)胞興奮性毒性是由于興奮性毒性氨基酸受體介導(dǎo)的鈣離子濃度增高導(dǎo)致線粒體損傷，從而引起氧自由基產(chǎn)物增高［3～5］。自由基一方面可引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，影響丙酮酸脫氫酶的活性，使葡萄糖的氧化分解發(fā)生障礙，乙酰膽堿合成不足，導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶功能呈漸進(jìn)性減退;另一方面可損傷線粒體DNA(mtDNA)，導(dǎo)致其編碼的呼吸鏈復(fù)合物酶蛋白亞基表達(dá)下降，酶活性降低，進(jìn)一步危害能量代謝機(jī)制。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，SOD是體內(nèi)天然的抗氧化物，能清除自由基而具有抗自由基損傷作用，MDA及SOD水平能間接反映腦組織中氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)平原大鼠在高海拔地區(qū)喂養(yǎng)后MDA含量升高，表明機(jī)體發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，而且機(jī)體清除自由基的能力下降。高海拔組SOD活性與對照組無顯著差異，其可能原因是長期、嚴(yán)重的低氧刺激可嚴(yán)重破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，特別是線粒體結(jié)構(gòu)。

COX是催化花生四烯酸(AA)合成前列腺素(PG)以及血栓素的限速酶，其活性對控制前列腺素類物質(zhì)的合成有重要作用。COX分為結(jié)構(gòu)型(COX-1)及誘導(dǎo)型(COX-2)。文獻(xiàn)報道，COX-2可能是腦缺血后氧自由基產(chǎn)生的主要機(jī)制。生理情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有少量COX-2表達(dá)，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，缺氧可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)COX-2表達(dá)。本研究高海拔組CA1區(qū)COX-2明顯高于低海拔組，依據(jù)COX-2于高原低氧應(yīng)激后的明顯表現(xiàn)，有理由推測高原低氧應(yīng)激可能通過COX-2過表達(dá)造成線粒體損傷，從而誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡。

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