李貴新，李鵬鑫，郭 璐，路 中，張金龍，張 敏

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261031)

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外應(yīng)用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞［1］。CIK具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感等特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)。2008年12月～2010年1月，我們將CIK與樹突狀細(xì)胞(DC)共培養(yǎng)成DCCIK細(xì)胞，觀察其對(duì)人白血病K562細(xì)胞、人淋巴瘤raji細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞殺傷活性的影響及CIK細(xì)胞的趨化性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 臍血由濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供(健康產(chǎn)婦分娩正常足月胎兒后于無菌條件下采集，經(jīng)肝素鈉抗凝)。人白血病K562細(xì)胞、人淋巴瘤raji細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD)，CD3單克隆抗體(北京博特納)，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)，γ-INF、IL-2、IL-4、IL-8、IL-1α、GM-CSF、TNF-α、PGE-2、MCP-1 等均購自上海普欣生物技術(shù)有限公司、CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)，倒置顯微鏡(重慶奧特)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(深圳雷杜)，離心機(jī)(北京白洋)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，趨化小室(江蘇麒麟貝爾)。

1.2 CIK、DC的誘導(dǎo)、擴(kuò)增和培養(yǎng) 無菌采集臍血，分別行CIK、DC誘導(dǎo)、擴(kuò)增和培養(yǎng)。收獲培養(yǎng)成熟的CIK、DC細(xì)胞計(jì)數(shù)后以DC∶CIK=1∶5的比例混合培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含IL-2 500 IU/ml的CIK細(xì)胞培養(yǎng)液，共培養(yǎng)3 d。

1.3 細(xì)胞殺傷率的檢測(cè) 以培養(yǎng)12 d的CIK、DCCIK作為效應(yīng)細(xì)胞，K562、raji、MCF-7細(xì)胞作為靶細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期K562、raji、MCF-7細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104/ml，CIK、DC-CIK的細(xì)胞濃度分別調(diào)整為2.5 ×105/ml、5 ×105/ml、1 ×106/ml，效靶比依次為為 5∶1、10∶1、20∶1。分為實(shí)驗(yàn)組、效應(yīng)細(xì)胞組、靶細(xì)胞組，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組每孔加效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞各100 μl，靶細(xì)胞組每孔加入靶細(xì)胞、1640培養(yǎng)液各100 μl;效應(yīng)細(xì)胞組每孔加入效應(yīng)細(xì)胞、1640養(yǎng)液各100 μl。置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性試劑盒說明書，加入MTT試劑10 μl每孔37℃孵育4 h，再每孔加入formazan溶液100 μl，37 ℃孵育4 h，待充分溶解沉淀后于全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)儀(波長570 nm)檢測(cè)吸光度值(A值)，計(jì)算殺傷率。殺傷率=［1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)孔A值)/靶細(xì)胞孔A值］×100%

1.4 CIK細(xì)胞趨化性檢測(cè) 采用趨化實(shí)驗(yàn)。吸取培養(yǎng)第12天的DC-CIK細(xì)胞，設(shè)立陰性對(duì)照組、K562培養(yǎng)上清液組、IL-8組、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)組，于趨化小室的下室分別加入PBS、K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液、rhIL-8、MCP-1。置細(xì)胞培養(yǎng)箱180 min后，顯微鏡下(200×)計(jì)數(shù)穿過濾膜的CIK細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC-CIK和CIK的殺傷活性 見表1。

表1 CIK和DC-CIK對(duì)K562、raji、MCF-7細(xì)胞的殺傷作用比較(%，±s)

表1 CIK和DC-CIK對(duì)K562、raji、MCF-7細(xì)胞的殺傷作用比較(%，±s)

注:與相應(yīng)效靶比的CIK細(xì)胞比較，*P＜0.01;與同一細(xì)胞效靶比5∶1比較，△P ＜0.05;與同一細(xì)胞效靶比10∶1比較，▲P ＜0.05

效應(yīng)細(xì)胞 K562細(xì)胞 raji細(xì)胞 MCF-7細(xì)胞CIK效靶比5∶1 20.94±1.99 19.60±2.39 16.09±1.88效靶比10∶1 37.49±2.99△ 33.73±2.64△ 27.98±1.84△效靶比20∶1 54.06±3.73▲ 52.17±2.53▲ 51.05±1.87▲DC-CIK效靶比5∶1 31.76±3.03* 28.52±1.96* 21.63±2.95*效靶比10∶1 46.03±2.57＊△ 41.20±2.80＊△ 33.73±2.06＊△效靶比20∶1 63.25±2.54＊▲ 62.29±3.18＊▲ 59.08±3.11＊▲

2.2 CIK細(xì)胞的趨化性 對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為(16.89±2.02)個(gè)，K562組為(17.60±2.27)個(gè)，IL-8組為(25.35±6.13)個(gè)，MCP-1組為(28.47±4.37)個(gè)。K562組與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-8組與對(duì)照組比較P=0.000 6，MCP-1組與對(duì)照組比較P=0.000 0。

3 討論

多項(xiàng)研究表明，CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)不僅能提高CIK細(xì)胞的殺傷作用，而且也能顯著提高DC的功能，DC-CIK的主要優(yōu)勢(shì)為:①增殖活性高。DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后產(chǎn)生的細(xì)胞比同源CIK細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖活性，經(jīng)抗原刺激后的DC-CIK細(xì)胞增殖數(shù)目進(jìn)一步提高，可獲得更多的效應(yīng)細(xì)胞［2］。②細(xì)胞毒活性強(qiáng)。DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)可增強(qiáng)CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。③細(xì)胞因子釋放量大。細(xì)胞IL-12的分泌量比CIK細(xì)胞和DC單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)明顯增加［3］。DC能使CIK細(xì)胞分泌IFN-7的時(shí)間延長，分泌量增加［4］。④表面標(biāo)志表達(dá)量高。DC表面的 HLA-I和 HLA-Ⅱ分子及 CD40、CD50、CD56分子的表達(dá)增加;CIK細(xì)胞的增殖及表面的 CD3、CD4、CD28、CD40分子表達(dá)增加［5］。⑤抑制性T細(xì)胞數(shù)量、IL-10分泌量減少。CIK細(xì)胞中具抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)的細(xì)胞減少，共培養(yǎng)物上清中具有免疫抑制作用的 IL-10 減少［6］。

CIK細(xì)胞來源于T細(xì)胞亞群。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-8、MCP-1作用后CIK穿膜細(xì)胞數(shù)明顯升高，而K562作用后穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯增高，證實(shí)IL-8、MCP-1對(duì)CIK細(xì)胞具有趨化性，而K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)CIK細(xì)胞無趨化性。

綜上所述，DC-CIK共培養(yǎng)可明顯提高CIK細(xì)胞毒作用;CIK細(xì)胞存在趨化性。本研究為臨床腫瘤的治療提供了新思路。

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