熊建軍,龔 幀,吳周環(huán),林 玲,甘麗君,黃愛君,李雪芹

(九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院,江西九江 332000)

研究證實,血管平滑肌細胞(VSMCs)異常增殖是高血壓的重要病理變化。VSMCs異常增殖使血管壁增厚,順應性下降,管腔狹窄,同時分泌眾多活性物質(zhì)及細胞外基質(zhì)成分,促進高血壓的病理過程。因此,抑制 VSMCs增殖是防治高血壓的重要途徑之一[1]。粟米草為番杏科植物,性味淡平,有清熱解毒、利濕功能,主治腹痛瀉泄、瘡疥腫毒等[2]。文獻報道,粟米草中提取的粟米草皂甙,具有抗心律失常、增加冠狀動脈血流量、降低血壓等藥理作用[3],但其降壓機制尚不明確。2008年 10月 ～2009年 7月,我們觀察了粟米草皂甙對 VSMCs增殖的影響,并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 粟米草皂甙,原代培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs(第 4～8代細胞),DMEM干粉,新生小牛血清,胰酶,青霉素,鏈霉素,四甲基偶氮唑藍(MTT),總 RNA提取試劑盒,一步法 RT-PCR試劑盒,β-actin及線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A(mtTFA)引物,CO2細胞培養(yǎng)箱,酶標儀,普通臺式離心機,電熱恒溫水浴箱,PCR儀,凝膠成像系統(tǒng),超凈工作臺,普通及低溫冰箱,普通及電子天平。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs增殖情況觀察 采用 MTT法。將VSMCs懸液以每孔 1×104個細胞接種于 96孔細胞培養(yǎng)板,待細胞貼壁生長良好后吸去原培養(yǎng)液,換含血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。實驗組加入粟米草皂甙,使其終濃度分別為 1、3、9、27μmol/L(其中 DMSO終濃度不超過 0.1%)；對照組加等體積稀釋后的 DMSO。每組均設(shè) 4個復孔。常規(guī)培養(yǎng)不換液,分別培養(yǎng) 24、48、72 h。實驗終止前加 MTT(5 mg/ml)20μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后離心棄上清液,加 DMSO 150μl,振蕩 10 min,溶解結(jié)晶物。酶聯(lián)免疫檢測儀上波長 490 nm處測各孔吸光度值(A值),以空白對照調(diào)零,計算對細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-觀察組 A值 /空白組 A值)×100%。

1.2.2 VSMCs中 mtTFA mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。Trizol試劑提取 VSMCs總 RNA,分光光度計測總 RNA純度。采用一步法 RT-PCR試劑盒,按照說明書操作,內(nèi)參照為 β-actin(475 bp)。反應結(jié)束后,取 PCR反應液 8μl進行 1.4%的瓊脂糖凝膠電泳,確認 PCR擴增產(chǎn)物。以目的條帶值與β-actin條帶的平均光密度值比值表示 mtTFA mRNA表達量。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS15.0軟件處理。組間顯著性檢驗采用 t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞增殖抑制率比較 見表1。由表可見,在粟米草皂甙濃度為 3～27μmol/L范圍內(nèi),細胞增殖抑制率與藥物濃度呈明顯依賴關(guān)系；且在一定濃度范圍內(nèi),粟米草皂甙對細胞增殖的抑制作用呈時間依賴關(guān)系。

2.2 兩組 mtTFA mRNA表達比較 見表2。由表可見,不同濃度粟米草皂甙作用后,VSMCs中 mt-TFA mRNA表達水平下降,隨濃度遞增下降更為明顯。

表1 兩組不同時間點細胞增殖抑制率比較(%,±s)

表1 兩組不同時間點細胞增殖抑制率比較(%,±s)

注:與對照組比較,*P＜0.05,#P＜0.01；與同組 24 h、72 h比較,△P＜0.05

組別 細胞增殖抑制率觀察組24 h 48 h 72 h 1μmol/L 20.3±4.6 23.9±6.4 28.6±5.6 3μmol/L 36.3±5.5* 48.0±5.8*△ 54.7±3.3*9μmol/L 44.8±4.5* 57.9±3.4#△ 66.8±4.6#27μmol/L 56.1±6.2# 60.2±5.0#△ 70.3±6.1#對照組 18.7±4.3 21.4±6.0 23.3±5.8

表2 兩組 mtTFA mRNA表達比較(±s)

表2 兩組 mtTFA mRNA表達比較(±s)

注:與對照組比較,*P＜0.05,#P＜0.01

組別 mtTFA mRNA觀察組24 h 48 h 72 h 1μmol/L 0.58±0.11 0.46±0.13 0.41±0.05 3μmol/L 0.44±0.08 0.27±0.06* 0.22±0.04*9μmol/L 0.31±0.07 0.18±0.05# 0.13±0.03#27μmol/L 0.23±0.04 0.11±0.05# 0.08±0.02#對照組 0.61±0.09 0.45±0.11 0.43±0.07

3 討論

粟米草為番杏科植物,包括星粟米草屬和粟米草屬,有清熱解毒、利濕等功能,其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是黃酮類和甾體類化學成分。我們的前期研究表明,非細胞毒劑量的粟米草提取物對高血壓大鼠有明顯的降壓效果,但是其作用機制尚不明確。

在動脈粥樣硬化、高血壓等疾病中,VSMCs異常增殖是重要的病理變化,抑制 VSMCs增殖與遷移可逆轉(zhuǎn)血管構(gòu)型,提高動脈粥樣硬化、高血壓等患者的生存率及生存質(zhì)量。目前,臨床上只有少數(shù)藥物如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等有類似療效。本研究結(jié)果顯示,不同濃度粟米草皂甙作用后均可抑制 VSMCs增殖,并且這種抑制作用隨著粟米草皂甙濃度增高而增強。這表明粟米草皂甙可有效抑制 VSMCs增殖,為闡明粟米草抗高血壓的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。

在體外培養(yǎng)中,血清對 VSMC增殖受細胞外和細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控,其中涉及多條通路。我們研究發(fā)現(xiàn),粟米草皂甙抑制 VSMCs的增殖與 mtTFA的轉(zhuǎn)錄表達存在關(guān)聯(lián)。已知 mtTFA是由核基因組編碼,在胞質(zhì)內(nèi)合成后再進入線粒體的蛋白分子,對線粒體增殖和功能起重要調(diào)控作用[4]。mtTFA從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體,作用于 mtDNA啟動基因,在線粒體 RNA聚合酶作用下,通過調(diào)節(jié) mtDNA輕鏈和重鏈的轉(zhuǎn)錄而控制 mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復制。因此,mtTFA是決定線粒體數(shù)量和轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵分子,對細胞增殖產(chǎn)生影響[5]。國外研究已證明,通過反義技術(shù)干預 mtTFA能顯著抑制平滑肌細胞的增殖[6]。本研究結(jié)果顯示,粟米草皂甙能抑制血清對mtTFA mRNA的表達,提示粟米草皂甙可能通過抑制 mtTFA mRNA高表達發(fā)揮抑制VSMCs增殖作用。已知 mtTFA表達受控于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,多種胞外信號如葡萄糖、LPS等可導致其啟動子的激活[7,8],引起蛋白表達升高。mtTFA啟動子的激活依賴于核呼吸因子 1和 2(NRF-1、NRF-2)[9],同時過氧化物酶體增殖物激活受體 γ輔激活因子-1(PGC-1)對NRF-1、NRF-2和 mtTFA等基因表達產(chǎn)生強大的誘導作用[10]。粟米草皂甙中的黃酮類和甾體類化學成分有可能在多個環(huán)節(jié)抑制 mtTFA的轉(zhuǎn)錄,從而抑制了 mtTFA蛋白的表達,最終導致線粒體功能改變,細胞增殖減少,其具體機制有待深入研究。

[1]Voelkel NF,Tuder RM.Cellular and molecular biology of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension[J].Pulm Pharmacol Ther,1997,10(5-6):231-241.

[2]姚果原,周凱旋,盧琦華,等.粟米草總皂甙的心血管藥理作用[J].九江醫(yī)學,1994,9(1):22-23.

[3]李雪芹,高春華,劉建云,等.粟米草提取物對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用[J].山東醫(yī)藥,2005,45(17):8-9.

[4]Reyes A,Mezzina M,Gadaleta G.Human mitochondrial transcription factor A(mt TFA):gene structure and characterization of related pseudogenes[J].Gene,2002,291(1-2):223-232.

[5]Freyssent D,Dicarlo M,Escobar P,et al.Zidovudine(AZT)induced alterations in mitochondrial biogenesis in rat striated muscles[J].Can JPhysiol Pharmacol,1999,77(1):29-35.

[6]Inagaki H,Kitano S,Lin KH,et al.Inhibition of mitochondrial gene expression byantisense RNA of mitochondrial transcription factor A(mtTFA)[J].Biochem Mol Biol Int,1998,45(3):567-573.

[7]Kain KH,Popov VL,Herzog NK.Alterations in mitochondria and mtTFA in response to LPS-induced differentiation of B-cells[J].Biochim Biophys Acta,2000,1494(1-2):91-103.

[8]Kanazawa A,Nishio Y,Kashiwagi A,et al.Reduced activity of mt-TFA decreases the transcription in mitochondria isolated from diabetic rat heart[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2002,282(4):778-785.

[9]Kraft CS,Lemoine CM,Lyons CN,et al.Control of mitochondrial biogenesis during myogenesis[J].Am JPhysiol Cell Physiol,2006,290(4):1119-1127.

[10]Anedersson U,Scarpulla RC.Pgc-1-related coactivator,a novel,serum-inducible coactivator of nuclear respiratory factor 1-dependent transcription in mammalian cells[J].Mol Cell Biol,2001,21(11):3738-3749.