王茜莎 楊威 陶淑娟 董金華 潘雪刁 張德志

欖香烯(elemene)是從姜科植物溫莪術(shù)(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling)的揮發(fā)油中經(jīng)減壓蒸餾獲得的以β-欖香烯為主，同時(shí)含少量δ-欖香烯及γ-欖香烯等成分的萜烯類化合物，屬國(guó)家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物[1]。目前臨床使用的欖香烯乳劑是以β-欖香烯為主要成分。δ-欖香烯是β-欖香烯的同分異構(gòu)體，實(shí)驗(yàn)研究表明δ-欖香烯能誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]，但對(duì)人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞的抗腫瘤作用至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在董金華等[3]大量提取δ-欖香烯工藝的基礎(chǔ)上，初步進(jìn)行了δ-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞的抗腫瘤作用研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑

δ-欖香烯和β-欖香烯均由沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院提供，其含量分別為95%、96.7%；用DMSO溶成8 mmol/L臨用前儲(chǔ)備液，用時(shí)培養(yǎng)基稀釋為適當(dāng)濃度用于體外實(shí)驗(yàn)。

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、左旋谷胱甘肽(L-Glutathione，GSH)購于Sigma公司； 氯甲基二氯熒光素二乙酸酯(6-Chloromethyl-2′，7′-dichlorofluorescin diacetate, CM-H2DCF-DA)和超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)和四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide，JC-1)購于美國(guó)Molecular Probes公司。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞、人正常肝胚胎WRL-68細(xì)胞購于American Type Culture Collection 機(jī)構(gòu)。接種在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%的 CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物

5～6周齡SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，18～22 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2007A006]。

2 方法

2.1 細(xì)胞體外生長(zhǎng)活性檢測(cè)

采用MTT法進(jìn)行。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DLD-1細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml接種于96孔板(100 μl/孔，5%CO2，37 ℃ 培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度的δ-欖香烯(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)100 μl/孔；同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(0 μmol/L δ-欖香烯)，復(fù)設(shè)3孔。藥物作用0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48 小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，向每孔分別加入20 μl的5 mg/ml的MTT存儲(chǔ)液，并于37℃孵育4小時(shí)。之后向每孔加入150 μl的DMSO，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)。按以下公式計(jì)算抑制率(IR)：IR=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度A值/對(duì)照組平均吸光度A值)× 100%，并用SPSS 11.0軟件計(jì)算δ-欖香烯的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2.2 正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝細(xì)胞WRL-68生長(zhǎng)抑制作用

2.2.1 骨髓細(xì)胞的制備

取5～6周齡小鼠3～5只，雄性，斷頸處死，無菌操作取小鼠股骨骨髓細(xì)胞，用不完全培養(yǎng)基(不含血清)的RPMI-1640培養(yǎng)液6 號(hào)針頭注射器沖出骨髓細(xì)胞，靜置數(shù)分鐘，取上層懸液，1200 r/min離心5分鐘，棄上清液；用加雙抗的不完全RPMI-1640培養(yǎng)液洗2次。采用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用RPMI-1640培養(yǎng)體系調(diào)細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml(或1×106個(gè)/ml)。

2.2.2 δ-欖香烯對(duì)骨髓細(xì)胞和WRL-68細(xì)胞增殖活性的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WRL-68細(xì)胞，以1×104個(gè)/ml接種于96孔板(100 μl/孔)；正常小鼠骨髓細(xì)胞以4×105個(gè)/ml接種于加到96孔板中(100 μl/孔)。次日加入不同濃度的δ-欖香烯(0～400 μmol/L)100 μl/孔，復(fù)設(shè)3孔。藥物作用24小時(shí)后棄培養(yǎng)基，按“2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)并計(jì)算IR。

2.3 線粒體膜電位的檢測(cè)

線粒體膜電位通常采用JC-1標(biāo)記法進(jìn)行測(cè)定。線粒體是否完整是通過檢測(cè)線粒體膜電位的變化來確定的。細(xì)胞接種同上。培養(yǎng)12 小時(shí)后，加入200 μM δ-欖香烯，藥物作用0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24 小時(shí)后，用300 nM的JC-1，37°C避光孵育15分鐘。然后用0.25%的胰酶消化收集1×106的細(xì)胞，并用冰冷的PBS洗一次，然后將收集的細(xì)胞用PBS均勻懸浮，立即用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)數(shù)2×105個(gè)的細(xì)胞即可。

2.4 檢測(cè)ROS的生成

過氧化氫物和超氧化物通常采用CM-H2DCFDA(美國(guó)Molecular Probe 公司)，參照文獻(xiàn)[4]稍作改進(jìn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DLD-1細(xì)胞，接種于100 mm 培養(yǎng)皿中。200 μM 的δ-欖香烯作用DLD-1細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后離心收集細(xì)胞，并用200 μl 的RPMI 1640 培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。然后加入10 μM CM-H2DCFDA于37℃孵育45分鐘，最后用PBS緩沖液清洗以除去CM-H2DCFDA。用流式細(xì)胞儀通過相對(duì)于正常細(xì)胞的熒光密度來檢測(cè)ROS的含量。GSH于δ-欖香烯作用前1小時(shí)進(jìn)行預(yù)處理，考察3小時(shí)對(duì)凋亡細(xì)胞的影響。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 δ-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞的增殖抑制

實(shí)驗(yàn)考察了δ-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞作用的時(shí)效關(guān)系，結(jié)果表明δ-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量依賴性(圖1)。δ-欖香烯分別作用DLD-1細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí)，其IC50分別為308.4 μmol/L、222.4 μmol/L和159.8 μmol/L(圖1)。

圖1 δ-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞作用不同時(shí)間的增殖抑制作用

3.2 δ-欖香烯對(duì)正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝WRL-68細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

圖2 δ-欖香烯對(duì)正常小鼠骨髓細(xì)胞及人正常胚胎肝WRL-68細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

由圖2可知，24小時(shí)時(shí)200 μmol/L 的δ-欖香烯對(duì)人正常肝胚胎WRL-68細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的抑制率僅在10%左右，400 μmol/L 其抑制率不到20%，提示200 μmol/L δ-欖香烯對(duì)WRL-68細(xì)胞和骨髓細(xì)胞增殖的抑制作用明顯較腫瘤細(xì)胞弱。

3.3 JC-1 檢測(cè)δ-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞線粒體膜電位(Δφm)的影響

經(jīng)200 μmol/L的δ-欖香烯作用后，DLD-1細(xì)胞的Δφm出現(xiàn)下降,如圖3所示。空白對(duì)照組中，絕大部分細(xì)胞(R1區(qū))發(fā)出標(biāo)志線粒體完整的高密度紅色熒光；δ-欖香烯作用組中，R1區(qū)的細(xì)胞顯著性減少，R2區(qū)的細(xì)胞是(明亮的綠色熒光同時(shí)伴有低密度的紅色熒光)細(xì)胞——標(biāo)志著線粒體膜電位降低——隨著藥物作用的時(shí)間增加而增加，即線粒體膜電位的降低呈時(shí)間依賴性。與空白對(duì)照組相比，200 μmol/L 的δ-欖香烯作用DLD-1細(xì)胞6 小時(shí)呈現(xiàn)綠色JC-1熒光(標(biāo)志著線粒體膜電位降低)，這與線粒體膜去極化降低相一致。

圖3 δ-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞膜電位的影響

如圖4結(jié)果所示，Dφm的降低隨著藥物作用的時(shí)間增加而增加，即線粒體膜電位的降低呈時(shí)間依賴性，6小時(shí)，12小時(shí)，24 小時(shí)線粒體膜電位降低的發(fā)生趨勢(shì)分別是空白組的(2.24±0.12)倍、(2.85±0.33)倍、(5.11±0.24)倍(與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01)。

圖4 δ-欖香烯不同時(shí)間對(duì)DLD-1細(xì)胞膜電位變化

3.4 δ-欖香烯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與ROS的生成增加有關(guān)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)δ-欖香烯所引起DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS的生成(圖5)。200 μM 的δ-欖香烯處理DLD-1細(xì)胞所引起的ROS的生成呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的增加。如圖5所示，200 μmol/L 的δ-欖香烯作用1小時(shí)、3小時(shí)和6小時(shí)所引起的ROS含量的增加，分別接近空白對(duì)照組的7.8倍、18.2倍和21.8倍，此增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(*P<0.01，**P<0.001)。此外，δ-欖香烯的這種作用可以被GSH(ROS的清除劑)顯著性抑制，即加入GSH后δ-欖香烯對(duì)ROS生成率(3.46%)與空白對(duì)照(2.11%)相比無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示δ-欖香烯誘導(dǎo)的DLD-1細(xì)胞凋亡過程可能與ROS的生成增加相關(guān)。

4 討論

近年來，非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的研發(fā)已成為國(guó)際藥品市場(chǎng)發(fā)展的重要趨勢(shì)。欖香烯體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用已有報(bào)道[5-6]。欖香烯對(duì)人正常末梢血白細(xì)胞的IC50值為1.244 mmol/L。本研究表明δ-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性，對(duì)DLD-1細(xì)胞的IC50值為222.4 mmol/L，此結(jié)果與欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞的IC50值極為接近(182.4 mmol/L)[7]。研究中同時(shí)采用MTT法比較了δ-欖香烯對(duì)人正常肝胚胎細(xì)胞WRL-68和小鼠骨髓細(xì)胞的作用，研究表明δ-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于對(duì)正常肝細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞的作用。δ-欖香烯對(duì)正常細(xì)胞的抑制作用很弱，即提示δ-欖香烯可能是一種無細(xì)胞毒性的活性單體。

圖5 δ-欖香烯致DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS生成(橫坐標(biāo)表示相對(duì)熒光密度，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)量)

圖6 δ-欖香烯不同時(shí)間致DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS量變化

目前認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)過量的ROS蓄積可以引起線粒體膜電位下降，直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。本研究表明，DLD-1細(xì)胞經(jīng)δ-欖香烯處理6 小時(shí)后，線粒體膜電位開始下降，是繼大量ROS 產(chǎn)生的后發(fā)事件。提示δ-欖香烯所致的線粒體膜電位下降是由于ROS蓄積而引起的。GSH 被認(rèn)為是平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子[9-10]。許多不同的抗氧化劑諸如NAC[11-12]、ascorbate[13]及α-tocopherol[13]的加入則抑制凋亡的發(fā)生，這表明ROS的生成在多種細(xì)胞凋亡中擔(dān)任了極其重要的作用。進(jìn)一步研究證實(shí)，很多抗腫瘤藥物在啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡過程前，細(xì)胞內(nèi)GSH 被耗竭，同時(shí)伴有活性氧的蓄積[14]。將DLD-1細(xì)胞在δ-欖香烯作用3小時(shí)前用GSH預(yù)處理，考察GSH對(duì)δ-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，δ-欖香烯所引起的凋亡作用可以被GSH完全抑制，其水平與空白組水平一致，即提示ROS在δ-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

總之，此次實(shí)驗(yàn)研究表明δ-欖香烯是一種非常有效的抗腫瘤活性單體，它能夠有效的誘導(dǎo)人結(jié)腸腺癌DLD-1細(xì)胞的凋亡發(fā)生，其凋亡機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

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